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前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)是一种含692个氨基酸的分泌型丝氨酸蛋白酶。它在肝细胞中表达后分泌至血浆能够与细胞膜表面的低密度脂蛋白受体(Low density lipoprotein receptor,LDLR)家族的成员结合,加速LDLR降解,从而减弱肝脏代谢血浆低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的能力。通过抑制PCSK9可以治疗高胆固醇血症,目前PCSK9完全人源及人源化单克隆抗体已进入三期临床阶段,但尚无相关的纳米抗体报道。特异性纳米抗体具有结构稳定、易于运输且制备成本低的明显优点。本文旨在制备纯化的人PCSK9蛋白,通过免疫骆驼制备PCSK9特异性重链抗体,为建立纳米抗体库进行高特异性纳米抗体筛选做准备;同时免疫小鼠获得PCSK9多克隆抗体,为制备单克隆抗体并最终生产特异性临床诊断试剂盒奠定基础。主要内容如下:(1)成功优化、合成和构建了在毕赤酵母GS115和中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)-s细胞表达人PCSK9的PCSK9-p PICZαA和PCSK9-pc DNA4.0质粒,实现了PCSK9-his重组蛋白在GS115和CHO细胞的分泌表达。Western Blotting结果显示GS115表达的重组蛋白分子量约为100 KDa,大于人天然PCSK9蛋白而且容易发生降解,上清蛋白纯化后无法定量及用于动物免疫实验;CHO细胞表达的蛋白分子量为60 KDa,与人天然PCSK9蛋白分子量相同,上清蛋白易于纯化,通过优化纯化条件可获得纯度达90%以上的PCSK9重组蛋白,且蛋白平均表达量达到5.6 mg/L以上。(2)用纯化的PCSK9重组蛋白免疫骆驼获得多抗血清,串联使用Protein G和Protein A蛋白纯化柱提取三次免疫后骆驼血清中的重链抗体,然后采用偶联PCSK9的磁珠进一步纯化,获得高纯度的PCSK9特异性重链抗体。(3)用纯化的PCSK9重组蛋白免疫小鼠获得多抗血清,采用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)测定三次免疫后获得的小鼠多抗血清的效价为1:80000以上。本研究成功建立了实验室快速生产制备毫克量级重组人PCSK9蛋白的方法,对比了两种体系表达PCSK9蛋白的差异,获得了PCSK9特异性重链抗体和小鼠PCSK9多克隆抗体,为后续采用蛋白质组学、高通量测序及噬菌体展示技术建立PCSK9特异性纳米抗体库、最终制备纳米抗体和PCSK9临床检测试剂盒奠定基础。