论文部分内容阅读
目前，乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤，近年来发病率呈逐年上升趋势，且发病有年轻化趋势。由于部分患者在发病前无明显症状，或症状未引起足够重视，导致病情进一步恶化，严重影响患者的生活质量，威胁患者的生命健康。随着乳腺癌综合治疗理念的日臻成熟，内分泌治疗，保乳手术，术后放疗化疗，和分子靶向治疗的综合应用使得乳腺癌患者的生存期得到了明显的延长。其中内分泌治疗又称激素治疗，作为乳腺癌综合治疗的重要组成部分，已受到广泛重视。内分泌治疗具有许多优点，如毒副作用小，有效期长，治疗期间患者生存质量较高等，可用于术后辅助治疗，也可作为复发转移后的补救治疗。他莫昔酚（tamoxifen）是乳腺癌内分泌治疗中应用最成熟的药物，它通过与雌激素竞争性结合雌激素结合受体（ER）阻断雌激素的生物学活性，抑制细胞的增殖，治疗乳腺癌。它可以显著提高ER阳性乳腺癌患者的总生存率和无瘤生存率，降低远处转移率。但乳腺癌对他莫昔酚原发性或获得性的耐药，是乳腺癌内分泌失败的主要原因之一。乳腺癌的他莫昔酚耐药机制非常复杂。研究发现，乳腺癌耐药性的发生与雌激素受体和生长因子受体间的相互作用、ER的缺失或突变均有相关性。最新的研究也显示，microRNA在乳腺癌耐药过程中发挥重要作用，microRNA-221/222在具有他莫昔酚耐药性的乳腺癌细胞系MCF-7细胞中含量明显增高。2008年，Adrian Harris课题组第一次在血清中发现了分泌型microRNA的存在，随后在唾液、乳汁和尿液中都发现了分泌型microRNA。与细胞和组织中提取的microRNA不同，血清中的microRNA，即使利用RNA酶降解，仍然保持高度的稳定性。最新研究指出，大部分的分泌型microRNA都存在于exosomes中。Exosomes即细胞外泌体，是一种可由多种细胞分泌的纳米级(30-100nm)的膜性小囊泡，它是由管内囊泡和细胞膜融合形成的。Exosomes可以由多种细胞分泌产生，并且在肿瘤生成、细胞应激、血管生成、细胞间信息交流等方面均有重要作用。那么，它们是否参与了肿瘤细胞获得耐药性的过程？为了探究分泌型microRNA-221/222是否能够增强ER阳性乳腺癌对他莫昔酚的耐药性，我们进行了以下实验并取得了一定结果。研究方法和结果：1、MCF-7wt和MCF-7TamR所分泌exosomes在形态上存在差异：（1）用透射电镜观察MCF-7wt和MCF-7TamR细胞所分泌的exosomes在形态上的差异。（2）对MCF-7wt和MCF-7TamR细胞分泌的exosomes进行蛋白质和RNA含量的分析。结果：MCF-7wt和MCF-7TamR细胞分泌的exosomes均为椭圆形的膜性小囊泡，染色后可见囊泡中央色淡、周边浓染，边缘清晰，但不同的是：MCF-7wtexosomes（约为65nm）的直径明显大于MCF-7TamRexosomes（约为40nm）；MCF-7wt（106个）细胞所分泌的exosomes含有的RNA和蛋白质的量均比MCF-7TamR（106个）细胞高。2、MCF-7TamR细胞他莫昔酚耐药性可通过exosomes传递：（1）用PKH67染色exosomes，并用激光共聚焦显微镜观察exosomes是否可以进入MCF-7wt细胞。（2）通过MTT实验、平板克隆形成实验、细胞凋亡检测实验观察MCF-7TamRexosomes是否可以促进MCF-7wt细胞对他莫昔酚的耐药。结果：MCF-7TamRexosomes确实可以进入MCF-7wt细胞；进而降低MCF-7wt细胞对他莫昔酚的敏感度，促进细胞平板克隆的形成，降低细胞的凋亡率，即增强了MCF-7wt细胞对他莫昔酚的耐药性。3、 MCF-7TamRexosomes传递细胞他莫昔酚耐药性依赖于分泌型microRNA-221/222：（1）microRNA芯片检测MCF-7wt与MCF-7TamR细胞和exosomes中分泌型microRNA的含量差异。（2）芯片结果分析，选取目标microRNA，并用qPCR检测（3） qPCR检测MCF-7TamRexosomes加入MCF-7wt细胞后microRNA-221/222含量的变化。（4）western blot检测microRNA-221/222的靶蛋白p27和ERα的变化。结果：MCF-7wt与MCF-7TamR细胞和exosomes存在分泌型microRNA的差异；MCF-7TamR细胞和exosomes中microRNA-221/222的含量均高于MCF-7wt细胞和exosomes；MCF-7TamRexosomes加入MCF-7wt细胞可明显增高细胞中microRNA-221/222的含量，同时microRNA-221/222靶蛋白p27和ERα的表达量降低。4、Anti-miR-221/222阻滞细胞他莫昔酚耐药性的传递：（1）转染Anti-miR-221/222，qPCR检测细胞中microRNA-221/222的含量变化，western blot检测靶蛋白p27和ERα的表达。（2）通过MTT实验、平板克隆形成实验、细胞凋亡检测等方法观察Anti-miR-221/222是否可以抑制MCF-7TamRexosomes传递他莫昔酚耐药性。结果：Anti-miR-221/222可以明显降低细胞中microRNA-221/222的含量；进而增强MCF-7wt细胞对于他莫昔酚的敏感度，抑制平板克隆的形成，同时提高细胞的凋亡率，即Anti-miR-221/222可以抑制MCF-7TamRexosomes传递他莫昔酚耐药性。结论：（1）MCF-7wt和MCF-7TamR细胞所分泌的exosomes在形态上存在差异。（2）相同细胞数下，MCF-7wt细胞所分泌的exosomes中RNA和蛋白质的含量高于MCF-7TamR细胞。（3）MCF-7TamRexosomes可以在ER阳性乳腺癌细胞间传递他莫昔酚耐药性。（4）MCF-7TamRexosomes传递他莫昔酚耐药性是通过分泌型microRNA-221/222。