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随着核能的发展和核技术的运用,人类在享受电离辐射带来便利的同时也正在遭受辐射损伤带来的危害。急性辐射损伤(Acute radiation injury,ARI)发病急骤、病情险恶,极易造成人体各系统或组织器官的辐射损伤。睾丸是一个辐射敏感组织,即使低剂量的电离辐射也能导致睾丸生精细胞凋亡,引发生精功能障碍,严重者甚至可以导致不育。目前,传统的辐射损伤防护剂对睾丸的急性辐射损伤的防护效果不尽如人意,因副作用大、价格昂贵等无法满足临床需求。因此研制一种高效、安全又经济的睾丸辐射损伤防护剂尤为迫切。目的研究急性辐射损伤的中医学病因病机,并据此探讨睾丸辐射损伤的防治方法。通过实验检验中药复方对小鼠睾丸辐射损伤的防护效应,并探讨TLR4和TLR5受体在其中的作用。方法理论研究:通过总结急性辐射损伤发生后的临床症状及证候表现,探讨急性辐射损伤的中医学病因。并根据急性辐射损伤的中医学病因,探讨睾丸辐射损伤的病机,根据病机再探讨适宜的防治方法。实验研究:实验一,雄性Balb/c小鼠按体重随机分为空白、模型两组,模型组以4.0 Gy 60Coγ射线照射,分别在照后14 d、21 d和35d,眼眶取血后断颈处死小鼠,检测各取材时间点小鼠睾丸的损伤情况,以及TLR4、TLR5在睾丸中的表达变化。实验二,初步考察中药复方对小鼠睾丸辐射损伤的治疗作用。实验小鼠分为空白组、模型组、阳性药组、中药组,仍以4.0 Gy剂量照射小鼠,照后给药14 d,然后分别在照后14 d、21 d和35 d处死小鼠,检测小鼠睾丸指数、精子浓度、精子活率、精子活力、正常形态精子百分比以及血清T、FSH、LH等指标。实验三:考察中药复方对小鼠睾丸辐射损伤的防护效应及部分机制。小鼠按体重随机分为空白组、模型组、阳性药组、中药高剂量组和中药低剂量组,给药10 d后以2.0 Gy 60Coy射线照射,分别在照射后7 d和21 d处死小鼠,检测生精细胞凋亡、周期和TLR4、TLR5、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-6 表达变化情况。结果1、理论研究发现,超过一定剂量的电离辐射致病急骤,病情严重,顽固难愈,符合中医毒邪的概念,但该毒邪特点鲜明,与温毒、火毒、光毒等传统毒邪明显不同,因此我们将引起急性辐射损伤的电离辐射命名为电离毒。而男性生殖系统辐射损伤因防治困难、病程长等因素,导致至今没有令人满意的防治措施和药物,以治未病思想指导男性生殖系统的辐射损伤防治,对于提高本病的疗效,改善患者的生活质量具有重要价值。2、4 Gy60Coγ射线对小鼠睾丸损伤严重:(1)4.0 Gy 60Coy射线照射后,Balb/c小鼠体重迅速减轻,在照射后4 d左右其体重开始恢复;照后小鼠睾丸辐射损伤发生,睾丸萎缩,睾丸指数在照后14 d即显著低于空白组小鼠(P<0.001)。(2)小鼠睾丸病理结果显示,受照组小鼠睾丸受损严重,生精细胞大量凋亡坏死,生精小管萎缩,生精上皮破损伤严重,受到的损伤随时间的推移加重。(3)照后14 d时,照射组小鼠血清T水平较空白组小鼠升高(P<0.05);照后21 d时,空白组小鼠血清LH升高;而小鼠血清中FSH水平变化不大。(4)照后14 d,TLR4mRNA水平变化不显著,NF-κBmRNA较空白组显著升高(P<0.05),TLR5、MyD88、TNF-α、IL-6mRNA 水平均显著降低;照后 21 d,TLR4/5、MyD88、NF-κ B、TNF-α、IL-6mRNA水平均显著降低;照后35d,TLR4、MyD88、IL-6mRNA水平较空白组低,TLR5、NF-κB、TNF-αmRNA水平变化不显著。(5)TLR4和TLR5在正常小鼠睾丸中也广泛表达,其中TLR4在睾丸支持细胞和间质细胞上高表达,电离辐射对TLR4在睾丸中的表达影响较小;TLR5在精子细胞上高表达,照射后TLR5在小鼠睾丸中表达增强,但在照后21 d和35 d时,随着精子细胞的数量减少,TLR5的阳性区域面积减小。3、中药复方对小鼠睾丸辐射损伤的治疗效应不显著:(1)Balb/c小鼠受4.0 Gy射线照射后,各受照组小鼠体重迅速减轻,模型组和阳性药组在照后4 d左右降至最低,之后开始缓慢恢复,中药组小鼠体重则持续降低,一直降至给药结束,也就是照后14 d,之后才开始缓慢恢复。照后各照射组小鼠睾丸指数下降(P<0.001),阳性药和中药复方的治疗效应不显著。(2)照后14 d时,各照射组小鼠精子浓度无显著性变化,照后21 d各照射组小鼠精子浓度显著降低(P<0.05),阳性药和中药复方的治疗作用不显著;照后14 d,各照射组小鼠精子活率和精子活力无显著性变化,照后21 d各照射组小鼠精子活率显著降低(P<0.01),精子活力也显著降低(P<0.001),照后35 d,各照射组小鼠精子活率和精子活力几乎为0;照射后14 d,模型组和阳性药组小鼠正常精子形态百分比与空白组比较无显著性差异,中药组小鼠正常形态精子百分比显著降低(P<0.05),照后21 d和35 d,各照射组小鼠正常形态精子百分比均显著降低,阳性药和中药复方的治疗效应不显著。综上,4 Gy 60Coγ射线对小鼠睾丸造成严重损伤,中药复方的治疗效应有待进一步研究。4、中药复方预防性给药能够在一定程度上防护2 Gy60Coγ射线造成的睾丸辐射损伤:(1)Balb/c小鼠受2.0 Gy射线照射前给予中药灌胃10 d,照后小鼠体重迅速下降,在照后4d降至最低,之后开始缓慢恢复。照射后7 d时,模型组小鼠睾丸指数较空白组显著降低(P<0.001),阳性药组和中药高剂量组小鼠睾丸指数显著高于模型组(P<0.05;P<0.01),表现出了一定的防护作用;照后21 d,各照射组小鼠睾丸指数均显著降低(P<0.001),给药组未表现出较好的保护作用。(2)照后7 d,模型组小鼠睾丸生精细胞凋亡率显著升高(P<0.05),各给药组与空白组比较无显著性差异;照后21 d时,模型组、阳性药组、中药低剂量组小鼠生精细胞凋亡率显著高于空白组(P<0.01),中药高剂量组也显著高于空白组(P<0.05),中药高剂量组表现出了较好的保、护作用。(3)照后7 d时,模型组小鼠1 C细胞较空白组显著降低(P<0.01),中药高剂量组显著高于模型组(P<0.05);照后21 d,各照射组小鼠睾丸中1 C细胞百分比均显著降低。照后7 d,中药低剂量组小鼠睾丸中2 C细胞百分比升高(P<0.05);照后21 d,各照射组小鼠睾丸中2 C细胞百分比均显著升高(P<0.001),其中中药高剂量组较模型组显著降低(P<0.05)。照后7 d,各个组小鼠4 C细胞百分比无显著性变化;照后21 d,各照射组小鼠睾丸内4 C细胞百分比较空白组显著升高。(4)照后7 d,模型组和中药低剂量组小鼠睾丸中TLR4mRNA水平较空白组显著降低(P<0.05),阳性药组和中药高剂量组与空白组比较无显著性差异;照后21 d,各照射组TLR4mRNA水平均显著降低。照后7 d,中药高剂量组小鼠睾丸内TLR5mRNA水平较空白组和模型组均显著升高(P<0.05),中药高剂量组MyD88、NF-κ BmRNA在照后7 d时也较空白组显著升高;照后21 d时,各照射组小鼠睾丸中TLR5、MyD88和NF-κ BmRNA水平均显著降低(P<0.001)。照后7 d,阳性药组和中药低剂量组TNF-α水平较空白组升高(P<0.01),各组IL-6mRNA水平无显著性差异;照后21 d,各照射组TNF-α和IL-6 mRNA水平较空白组均显著降低(P<0.001)。(5)免疫组化半定量结果发现电离辐射对小鼠睾丸中TLR4的表达影响不显著,在照后7 d时,中药高剂量组小鼠睾丸中TLR5表达较空白组显著升高(P<0.05);照后21 d,模型组和阳性药组TLR5表达较空白组显著升高(P<0.01),中药低剂量组较模型组TLR5表达显著降低(P<0.05),中药高剂量组较空白组表达降低(P<0.05),较模型组也显著降低(P<0.001)。结论1、通过实验我们发现电离毒致病急骤、损伤严重、治疗困难,因此运用中医“治未病”理论,在电离毒致病前即予以中药防护,以起到减轻睾丸辐射损伤的目的。2、本实验睾丸辐射损伤模型复制成功,照后给药治疗效果不显著,这可能与照射剂量过大有关,其机制尚待进一步研究;而照前给予中药预防能起到较好的保护睾丸的作用,与理论研究结果一致,进一步说明“治未病”理论指导下的中药防护小鼠睾丸辐射损伤具有重要意义。3、电离辐射能够引起小鼠睾丸中TLR4和TLR5的表达变化,中药复方能够在一定程度上调控其变化,但具体机制仍有待进一步探讨。