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目的:前列腺癌(prostate cancer,PCa),是男性泌尿系统里常见的恶性实体肿瘤之一,世界范围内其发病率排在男性癌症的第二位,仅次于肺癌。前列腺癌的分布存在明显的地区差异,在美国,前列腺癌已经是男性发病率第一和死亡率第二的肿瘤,分别占男性恶性肿瘤总发病率的19%和总死亡率的9%。随着我国的社会发展,人口逐渐老龄化,膳食结构及生活方式西化,医疗早期检验筛查水平提高,前列腺癌的发病率逐年增高且增长迅速。2018年初国家癌症中心最新发布的报告显示,前列腺癌已经超过膀胱癌成为我国男性泌尿系统发病率第一的恶性肿瘤。本课题组前期通过蛋白质组学研究筛选了良性前列腺增生与不同级别PCa患者的血清和尿液中的差异表达蛋白,进行生物信息学分析确立候选蛋白质PF4V1(血小板因子4变体,platelet factor 4 variant 1),并用ELISA等实验在另外100余例患者血清和尿液中验证了PF4V1具有同样表达趋势。PF4V1是一种能显著抑制新血管生成的趋化因子,由血小板、平滑肌细胞、肿瘤细胞等分泌。PF4V1有抑制内皮细胞迁移和抗血管生成的作用,近年来研究发现PF4V1在卵巢癌、骨肉瘤、黑色素瘤中与正常对照相比表达异常,过表达PF4V1会抑制肿瘤细胞的增殖及转移。但相关研究尚处于初级阶段,PF4V1在肿瘤微环境中通过何种信号通路发挥功能,PF4V1在不同肿瘤中增殖、侵袭、转移的机制等问题并不清楚。目前,国内外关于PF4V1在前列腺癌中的功能和作用机制未见报道。研究方法:第一部分,我们利用公共数据库(GEO,TCGA)大样本的临床资料来探索PF4V1在前列腺癌组织中的表达差异及预后价值。通过western blot,荧光定量PCR的方法对PF4V1在前列腺癌细胞系的表达水平进行验证。利用PF4V1慢病毒转染以过表达PF4V1。通过CCK-8,克隆形成实验,划痕实验,transwell实验等研究PF4V1对前列腺癌细胞的增殖,迁移,侵袭等生物学行为的影响。在裸鼠移植瘤模型中探索PF4V1蛋白对肿瘤的治疗作用。第二部分,我们通过多个生物信息学数据库软件预测可能结合并调控PF4V1的miRNA。利用mimics转染来过表达miRNA,观察miRNA是否对高表达PF4V1的PCa细胞有调控作用。通过双荧光素酶报告基因实验证明miRNA与靶分子mRNA的结合区域位点。我们还利用多种通路富集分析如GO,KEGG,PPI,INTERPRO来寻找PF4V1相关的信号通路,并通过western blot探索PF4V1在前列腺癌的下游关键蛋白的表达差异。以期拓展对PF4V1在前列腺癌中的功能和调控机制的认识,并为潜在的治疗应用提供分子靶点。结果:第一部分:1.我们检索GEO数据库中的前列腺癌基因表达,选取了两个不同的数据集,GSE60329和GSE55945。GSE60329数据集包含54例前列癌标本,和14例正常前列腺对照组织。GSE55945数据集包含13例前列癌标本,和8例正常前列腺对照组织。PF4V1 mRNA在以上两个数据集的前列腺癌组织中表达水平低于正常前列腺组织对照组(P<0.05)。2.TCGA数据库中,PF4V1在497例前列腺癌组织中的表达水平低于52例正常前列腺组织,存在显著统计学差异(P<0.05)。3.PF4V1在PCa中具有预后相关性。我们分析490例前列腺癌患者的生存资料,通过Kaplan-Meier生存曲线发现:PF4V1/TP53高的PCa患者,其无疾病进展生存时间较短(P<0.05)但总生存时间更长(P<0.05)。4.过表达PF4V1抑制PCa细胞增殖。我们利用嘌呤霉素筛选了稳定转染过表达PF4V1慢病毒的DU145和LNCaP细胞系。CCK-8实验显示:与转染空病毒的对照组相比,稳定过表达PF4V1的PCa细胞系在48h的吸光度明显降低(P<0.05)。克隆形成实验显示:与对照组相比,稳定过表达PF4V1的PCa细胞系的克隆数量明显减少(P<0.05)。5.过表达PF4V1抑制PCa细胞迁移。划痕实验显示:稳定过表达PF4V1的PCa细胞系在24h的划痕宽度明显高于对照组(P<0.05)。Transwell实验提示:与对照组相比,稳定过表达PF4V1的PCa细胞系的穿过小室膜的细胞数量明显减少(P<0.05)。6.过表达PF4V1抑制PCa细胞侵袭。铺设基质胶的transwell实验提示:与对照组相比,稳定过表达PF4V1的PCa细胞系的穿过小室膜的细胞数量明显减少(P<0.05)。第二部分:1.我们利用6种生物信息学软件miRanda,miRDB,miRwalk,PICTAR,RNA22,Targetscan来预测可能与PF4V1结合的miRNA,按结果个数从高到低取交集排序,得到8个候选:miR-129-5p,miR-27a,miR-374a,miR-875-3p,miR-543,miR-27b,miR-410,miR-1299。2.在DU145细胞系转染这8种miRNA的mimics,发现过表达miR-875-3p促进稳转过表达PF4V1的DU145细胞的增殖水平(P<0.05)。3.转染miR-875-3p mimics组的稳转过表达PF4V1的DU145细胞,PF4V1的mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)。4.转染miR-875-3p mimics组的稳转过表达PF4V1的DU145、LNCaP细胞,增殖、迁移、侵袭能力,显著高于转染空mimics对照组(P<0.05)。5.双荧光素酶报告基因实验显示,共转染野生型PF4V1荧光素酶报告质粒与miR-875-3p mimics的相对荧光强度显著低于突变型组及对照组(P<0.05)。6.GO/KEGG/PPI/INTERPRO等分析显示,PF4V1主要通过“趋化因子信号通路”,“细胞因子及其受体互作”来调节“炎症、迁移、刺激、应激、免疫、损伤和血管生成”等生物学过程。7.Western blot结果显示,过表达PF4V1的DU145、LNCaP细胞系中,p-AKT,p-ERK和SRC-1蛋白表达降低,Snail/Slug/N-cadherin蛋白表达下调而E-cadherin蛋白水平上调。结论:1.PF4V1在PCa组织及细胞系中低表达,且PF4V1/TP53与无病进展生存及总生存相关。2.过表达PF4V1显著抑制PCa细胞的增殖、迁移、侵袭,瘤体内注射PF4V1蛋白质明显抑制PCa的在体生长。3.MiR-875-3p靶向结合PF4V1的3’-UTR中174-180区域,上调miR-875-3p能部分逆转PF4V1对PCa增殖、迁移、侵袭的抑制作用。4.PF4V1通过趋化因子通路下游的AKT/ERK/EMT等通路在PCa中发挥抑制作用。