研究背景先天性巨结肠症(congenital megacolon,Hirschsprung’s disease,HD),又称先天性无神经节细胞症或先天性巨结肠,是一种发育性疾病,其特征是在结肠粘膜下层(Meissner’s)和肌间神经(Aurbach’s)丛中缺乏神经节细胞,远端结肠自病变肠段向近端延伸扩张,导致功能性肠梗阻。该病的发病率为1:5000。先天性巨结肠是由于肠神经嵴细胞(gut neural crest cells,GNCCs)在妊娠第4周至第12周期间神经嵴细胞迁移失败而引起的,导致全部或部分结肠中缺乏神经节细胞。胚胎发育过程中神经节段主要从近端向远端延伸,直肠及远端结肠亦可从肛门开始向近端双向延伸。先天性巨结肠症的临床表现范围可从新生儿的肠梗阻到大龄儿童的慢性便秘和腹胀,严重病例可出现肠穿孔乃至死亡。目前的诊断方法主要有肛门直肠测压、放射学研究和直肠壁活检的组织学检查。先天性巨结肠症的形成病因有许多,目前,国内外学者已经对HD的发病机制进行了初步的探讨。HD在形态学上的主要表现为肠神经节细胞缺乏或发育异常、多种类型的神经纤维异常增生或缺乏以及起搏细胞的异常。这些形态学上的异常可能主要是由两方面变化形成的:基因异常和肠壁微环境的变化。其中,基因突变是HD病发的主要原因。HD发病被认为是一种以RET原癌基因为主的多基因遗传病。迄今为止,除了 RET原癌基因,还有以下基因与HD的发病有关,包括胶质细胞源性神经营养子基因(GDNE)、内皮素3基因(END3)、内皮素受体p基因(EDNRB)、SOX10基因、ECE1基因、NRG1基因和Neuroligin(Nlgn)基因等。其中,Nlgn是一种神经粘连蛋白基因,具有高度保守结构的细胞粘附分子,其与神经毒素在中枢神经系统的突出的形成和功能中起作用。Nlgn 基因包含 Nlgnl,Nlgn2,Nlgn3,Nlgn4X 和 Nlgn4Y。Nlgnl 主要存在于兴奋性突触,Nlgn2和Nlgn4主要存在于抑制性突触,Nlgn3在这两种突触中均存在。此外,在研究Neurexin(Nrxn),Neuroligin(Nlgn)基因在肠道神经系统发育中的作用机制过程中,我们发现Nrxn和Nlgn基因在HD病变肠管中的表达存在异常,即这两个基因编码蛋白的表达量由扩张段到移行段再到狭窄段逐渐减少,而Nrxn和Nlgn基因分别编码突触前和突触后跨膜吸附蛋白,对神经细胞之间突触的形成、发育和功能起着非常重要的作用。此外,在肠壁微环境变化的条件下,GNCCs的迁移会发生停顿,或者移至正常部位后由于微环境的变化出现局部的发育异常,从而导致HD等肠神经发育异常的疾病。此外,如果GNCCs在肠道中停顿的时间越早,那么局部异常的部位越高,病变的肠道越长。这些结果均表明GNCCs的生长、发育和迁移的过程与肠道微环境密切相关,并且细胞外基质是影响肠道微环境的最重要成分,细胞外基质的异常可能会导致GNCCs的生长、发育和迁移的异常。其中,纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)是细胞外基质中的一种糖粘连蛋白和重要的细胞粘附分子,具有高度保守的结构域结构。FN广泛存在于组织和组织液中,由神经元和神经胶质细胞等产生,可以调节细胞的粘附、生长、分化并促进细胞增殖周期和基因表达。有研究表明,FN通过促进细胞外基质活化,存活,迁移,增殖和分化,参与血管的形成和重塑。FN也可能参与将生长因子以某种方式呈现给其同源受体,以增强预期的生理效应。此外,FN能够促进细菌与其他细胞的粘附,从而在哺乳动物机体内起到粘附分子的作用,从而达到保护其健康。在神经嵴细胞发育过程中,细胞外基质发挥着重要作用。有研究表明细胞外基质成分的过度增多,会导致GNCCs的过早分化、成熟、粘附、聚集,在其正常迁移之前定居而不能到达结肠远端,从而导致了无神经节细胞症的发生。因此我们推测FN对GNCCs的生长、迁移、增殖和分化都起着一定的作用,从而影响着HD的发生和发展。关于HD发病机制的基础性研究已经有很多,但都是从单一方面进行研究的。因此,为了更好的了解HD发病机制,我们需要将基因变异和肠壁微环境异常这两方面结合起来,进行更加深入的研究分析。研究目的因此,本研究主要筛选先天性巨结肠症的差异表达基因并进一步验证;从功能上分析差异表达基因对HD发病的影响;分离原代GNCCs细胞,并分析基因Nlgn和FN上调或下调对GNCCs细胞功能有何影响,并且如何在先天性巨结肠症中发挥作用。研究方法(1)首先从NCBI Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中下载有关儿童先天性巨结肠症和正常儿童样本的表达谱,利用NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlrn.nih.gov/Blast.cgi)工具对所有样本表达谱进行比对,再结合HUGO Gene Nomenclature Committee(HGNC)数据库对所有基因进行重新注释。然后根据R语言中的paired ttest算法,选取false discovery rate(FDR)值小于0.05且|Log2fold change(FC)｜>0.5作为筛选差异表达基因的阈值,再利用DAVID软件对所选的差异表达基因进行GO生物学过程和KEGG信号通路分析,筛选出与显著差异表达基因显著关联的GO生物学过程和KEGG通路。之后,再利用WGCNA算法构建与HD疾病表征显著相关的lncRNA、mRNA共表达网络。最后,通过 Comparative Toxicogenomics Database 2019 update(http://ctd.mdibl.org/)数据库,筛选出与HD相关的潜在生物标志物,并且从NCBI数据库中下载另外一组疾病和正常样本数据,作为验证这些差异表达基因的数据集。(2)从怀孕14-17天的KM小鼠中取出胎鼠,无菌条件下取出胎鼠的肠管(从十二指肠到结肠肠管),经过一系列处理后得到原代肠神经嵴细胞(GNCCs)。GNCCs通过培养传代后,用免疫荧光和免疫细胞化学染色的方法进行鉴定GNCCs,并通过PCR的方法进一步验证GNCCs中Nlgn和FN这两种基因的存在情况。(3)用不同浓度的Nlgn和FN蛋白浓度共同处理GNCCs细胞,处理48小时后,进行细胞迁移(transwell)的测定,从而确定最佳的Nlgn和FN蛋白浓度,用于后续的实验。然后利用最佳的Nlgn和FN蛋白浓度处理GNCCs,实验分组为FN组,Nlgn组,FN+Nlgn组和空白对照组。细胞处理48小时后,用CCK-8方法检测各组细胞的增殖能力,然后进行统计比较分析,从而研究这两个基因对GNCCs细胞功能的影响。实验结果1.通过生物信息学的分析,我们总共筛选到864个差异表达基因(DERs),包括45个lncRNAs(33个下调和12个上调lncRNAs)和819个mRNA(532个下调和287个上调mRNAs,其中Nlgn和FN基因显著表达)。2.根据GO和KEGG分析,结果发现这些差异表达基因富集到19个GO通路和1 1个KEGG通路,并且这些基因主要与生物学过程有关,包括negative regulation of growth and ion transmission(FDR:1.74E-04),cellular response to zinc ion(FDR:8.72E-04)和 cell adhesion(FDR:1.00E-02)。此外,这些差异基因还富集于 mineral absorption,protein digestion and absorption 等这些通路。3.通过构建基因共表达网络,发现了 8个显著基因共表达模块,并且包括575个边和 175 个节点(35 个black nodes,108 个brown nodes 和 32 个pink nodes)。在网络中,这些节点都表示上调。4.对共表达网络进行功能分析,发现了 8条KEGG通路,并且主要作用于cell cycle(p=3.17E-04)和 p53 通路(p=6.79E-04)。5.通过进一步的分析,发现与HD显著相关的通路是calcium signaling pathway和 pathway in cancer,并且发现了 4 个 lncRNAs(LINC00619,LINC00924,LINC00261 和 DRAIC)和 5 个 mRNAs(CYCS,CCND1,BDKRB,ITGA6 和TNNC1)与HD显著相关。6.从怀孕小鼠中提取原代GNCCs,通过免疫荧光和免疫细胞化学染色后,发现p75染色在提取的细胞中呈现阳性,且PCR的研究结果表明,在提取的细胞中,Nlgn和FN基因显著表达,证明了我们所提取的原代细胞属于肠神经嵴细胞。7.用不同浓度的Nlgn和FN蛋白处理GNCCs后,通过Transwell检测,发现用50μg/ml FN+400ng/ml Nlgnl处理细胞后,细胞迁移数增加,故用该浓度开展后续的实验。8.CCK-8实验结果表明同时使用FN和Nlgn处理GNCCs后,细胞增殖和迁移能力均发生明显变化。研究结论通过生物信息学的分析,lncRNAs LINC00619,LINC00924,LINC02和DRAIC和5个mRNAs CYCS,CCND1,BDKRB,ITGAd 和 TNNC1 及 2 个显著差异表达基因Nlgn和FN可能作为潜在的生物标志物,参与HD的发病进展。不同Nlgn和FN蛋白标准处理原代GNCCs细胞48小时后,表明Nlgn和FN会影响GNCCs的迁移和增殖能力,从而影响先天性巨结肠症。研究意义通过本研究,发现Nlgn和FN可以作为影响先天性巨结肠症的生物标记物,及影响先天性巨结肠的生物通路,可能为先天性巨结肠的诊断和发病机制提供新的见解。