适宜的环境温度是生命赖以生存的必要条件。而极端的环境温度对神经系统具有重要影响,从本能行为到高级认知行为均受到环境温度的影响。神经系统通过感知环境温度变化的适应性调整机体行为状态,以更好的适应极端环境。结合专业背景和研究方向,本文以小鼠和人为实验对象,从本能的摄食行为到高级注意功能对不同环境温度下神经系统的适应性调整能力进行解析。第一部分 腹内侧视前区调控温度依赖性摄食行为的神经环路机制从啮齿类动物到人类均拥有完善的体温调控系统。核心体温的稳定是机体细胞、组织与器官生理活动的必要条件。机体通过调控食物摄入与能量消耗达到产热与散热平衡是体温恒定的决定因素。当环境温度改变时,机体产热需求与散热负荷随之改变,相应的,机体会适应性的调整食物摄入与能量消耗,然而目前这种适应性调整的神经机制并不完全清楚。视前区(preoptic area,POA)作为温度感知与调控的中枢,接受脊髓、臂旁核等外周传入的温度信号,对冷热信号做出不同响应后作用到下丘脑背内侧核(dorsomedialhypothalamus,DMH)调控褐色脂肪组织产热与能量代谢速率,是体温调控的重要环节。另一方面在面临不同环境温度后,机体会依据能量需求与散热负荷对食物摄入做出温度依赖性的调整,例如高温与低温环境下摄食量会相应的增加和减少,然而其底层的神经机制并不清楚。由于这一机制不明,我们目前仍然未能全面认识体温调控的神经机制,也对临床发热性摄食异常等疾病,如炎症性厌食、癌症与艾滋病晚期发热性厌食缺乏深入的认识与应对策略。基于上述背景,本文旨在解析腹内侧视前区(ventromedial preoptic area,VMPO)感受环境温度信息后调控摄食行为的神经环路机制,并揭示VMPO调控温度依赖性摄食行为的温度感受特性及功能意义。VMPO位于第三脑室边缘,血脑屏障薄弱,拥有大量感受脑脊液渗透压感受器、性激素、甘丙肽、瘦素等激素受体,在调控机体体温平衡、水盐平衡、交配行为、母性行为等多个方面具有重要意义。VMPO内第三脑室前腹侧室周结构损伤后,动物表现出食物与水分的摄入平衡障碍。在VMPO区域注射生长激素释放因子或甘丙肽会增加动物摄食量,激活或阻断VMPO部位的食欲素Orexin A受体也会对动物摄食行为产生影响。然而VMPO是否具有调控摄食行为的作用及具体神经环路机制,目前并不清楚。为此,我们主要开展如下实验:1、首先,我们采用形态学染色技术,在POA多个具有温度敏感功能的亚区中发现VMPO表达与禁食相关的C-FOS,并通过免疫荧光共标、光纤记录与光遗传技术,明确VMPO部位可能参与摄食相关的神经元类型;2、然后,我们采用神经顺行示踪技术,对VMPO顺行投射脑区进行示踪,结合光遗传、化学遗传与神经诱导凋亡技术,对VMPO神经投射通路的功能意义进行逐个解析,筛查出参与调控摄食行为的VMPO通路;3、紧接着,我们采用形态学逆行示踪技术,明确VMPO投射通路的形态学基础,结合C-FOS染色与光遗传技术,探究VMPO投射通路的温度感受特性与功能意义;4、最后我们采用在体光纤记录结合逆行示踪技术,对VMPO投射通路的温度感受特性进行进一步的研究,建立温度感知与摄食行为的功能学联系。主要研究结果为:1、小鼠在不同温度环境(高温:33.5±2℃、常温:25±2℃、低温10±2℃)进行短时(2h)与长时(12h)暴露下摄食行为均表现出一定的温度依赖性。相对于常温,低温下摄食量显著升高,高温下摄食量显著降低。进一步我们对12h内不同温度环境暴露下小鼠血液内主要食欲相关激素水平,包括胃饥饿素、瘦素以及神经肽Y进行测定,发现血液激素水平并没有表现出明显的温度依赖性。随后我们对禁食状态下POA区域神经元活动标志物C-FOS的表达进行研究,发现在POA多个温度敏感性亚区中仅有VMPO区域在禁食状态下表达大量C-FOS。随后在Ai9::Vglut2-cre和Ai9::Gad2-cre两种双转基因小鼠上,对禁食诱发的C-FOS进行染色,发现VMPO部位禁食诱发的C-FOS与兴奋性的Vglut2阳性神经元具有较高的共标率,而与Gad2阳性神经元共标率较低。为此我们进一步采用钙信号光纤记录技术发现在Vglut2-cre小鼠VMPO部位注射钙活动指示剂Gcamp6s,小鼠禁食12h后在摄食过程中钙信号活动逐渐下降,而在Gad2-cre小鼠VMPO部位注射的Gcamp6s,在禁食12h后的摄食过程中无显著变化。这些结果表明VMPO部位Vglut2阳性神经元在饥饿状态下呈兴奋状态,在摄食状态下饥饿得以缓解后,其活动逐渐降低,意味着VMPO部位Vglut2阳性神经元活动与小鼠饥饿状态有关,可能参与摄食行为的调节。最后我们在Vglut2-cre与Gad2-cre小鼠VMPO部位注射光敏感病毒CHR2,采用光遗传技术激活VMPO部位Vglut2阳性神经元与Gad2阳性神经元,发现激活Vglut2阳性神经元可引起小鼠体温下降,同时摄食行为也下降,而激活Gad2阳性神经元体温与摄食行为无明显变化,初步排除了 VMPO部位Gad2阳性神经元可能参与摄食行为的调控;2、在前文研究基础上,我们对VMPO部位谷氨酸能神经元顺行投射通路进行示踪与功能解析,旨在寻找VMPO能够特异性调控摄食行为,而不引起其他非特异性行为指标变化的投射通路。我们在Vglut2-cre小鼠VMPO部位注射顺行示踪病毒AAV-DIO-CHR2-EYFP,我们发现VMPO部位谷氨酸能神经元从头端向尾端经下丘脑、丘脑多个核团存在广泛性投射,主要包括体温感受与调控核团,如视前区正中核(median preoptic nucleus,MnPO)、下丘脑背内侧核(dorsomedial hypothalamic nucleus,DMH),摄食行为调控核团如外侧下丘脑(lateral hypothalamic area,LH)、下丘脑室旁核(paraventricular nucleus of hypothalamus,PVH)、弓状核(arcuate hypothalamic nucleus,ARC)、结节核(tuberal nucleus,TN)等,也包括动机奖赏类脑区如中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray,PAG)、腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA),以及应激与情绪调控相关脑区如终纹床核(bed nucleus of the stria terminalis,BNST)、丘脑室旁核前部(anterior paraventricular thalamic nucleus,PVA)、丘脑室旁核(paraventricular thalamic nucleus,PVT)、杏仁核海马联合区(amygdalohippocampal area,AHiPM)。采用光遗传技术对VMPO下行通路的纤维末梢上的CHR2进行激活,记录小鼠禁食12h后2小时内的摄食量,我们发现激活VMPO→ARC通路末梢可以显著增加小鼠摄食量,而激活VMPO→PVH通路末梢会明显抑制小鼠摄食,激活VMPO→ARC与VMPO→PVH两条通路末梢小鼠仅表现出特异性的摄食变化,未表现出核心体温以及其他行为异常。而激活VMPO→DMH通路小鼠表现出摄食行为抑制,但同时也表现出明显的冷防御—筑巢行为。进一步我们采用顺行跨突触病毒结合与细胞凋亡技术,在VMPO部位注射顺行跨突触的重组酶AAVl-cre,在下游ARC、PVH以及DMH部位注射cre依赖的表达细胞内切酶的AAV-flex-tacasp3病毒,诱导VMPO→ARC、VMPO→PVH与VMPO→DMH通路突触后神经元凋亡。结果进一步确证了 VMPO→ARC、VMPO→PVH可以特异性的调控摄食行为,而不引起核心体温等其他指标与行为的变化,VMPO→DMH通路凋亡后,摄食行为无特异性影响,而是引起了小鼠体重增加,并且小鼠面临高温与低温环境时体温调控能力的出现部分缺失。最后我们采用化学遗传技术,在VMPO部位注射顺行跨突触的重组酶AAVl-cre,在下游ARC、PVH部位注射cre依赖的表达抑制性人工受体hM4D的AAV-DIO-hM4Di-mcherry病毒,抑制VMPO→ARC、VMPO→PVH通路突触后神经元,发现VMPO→ARC通路抑制后,小鼠在不同温度环境下摄食量均出现下降,VMPO→PVH通路抑制后,小鼠在不同温度环境下摄食量均出现上升,且小鼠无明显体重及体温调控的异常。由此我们进一步明确了 VMPO主要通过VMPO→ARC、VMPO→PVH两条通路对摄食行为进行调控,从调控后小鼠的摄食量上看,VMPO→ARC、VMPO→PVH两条通路并没有引起小鼠的严重厌食及过量摄食的现象,因此这两条通路主要是对摄食进行适量性调控;3、通过逆行形态学示踪技术与光遗传调控技术对VMPO→ARC与VMPO→PVH这两条通路进行反向的形态学与功能学解析。利用AAVretro-cre重组酶与Ai9工具鼠相结合,我们发现VMPO部位有大量逆行性胞体投射至ARC与PVH部位,并且均与禁食诱发的C-FOS存在共标,为VMPO→ARC与VMPO→PVH两条通路参与摄食行为调控奠定了形态学基础。进一步通过形态染色,我们发现VMPO投射至ARC的部位的胞体仅与冷刺激(10±2℃,2h)诱发的C-FOS共标,而与热刺激(33.5±2℃,2h)诱发的C-FOS无共标;而从VMPO投射至PVH部位的胞体与冷热两种刺激诱发的C-FOS均存在共标。进一步我们采用光遗传技术与逆行示踪技术相结合,在ARC与PVH部位注射逆行性重组酶AAVretro-DIO-flp,在VMPO部位注射AAV-fDIO-CHR2光遗传病毒,刺激从ARC与PVH逆行转染至VMPO部位的胞体,我们发现VMPO部位对两条通路的投射胞体激活后,小鼠表现出一致的体温自主调节模式,均表现出大幅度的核心体温下降,全身散热速度加快,褐色脂肪产热被抑制。但是两条通路激活后小鼠表现出不一致的热行为调节模式,在两箱位置偏好测试中(冷箱12℃,热箱38℃),光刺激两条通路前小鼠均偏好在热箱端停留,停留时间占80%左右。采用光遗传激活VMPO→ARC后小鼠位置偏好未发生明显变化,仍然偏好停留在热箱端,而激活VMPO→PVH后小鼠在冷箱停留时间明显增长,热箱停留时间明显减少,各占50%左右。上述结果表明VMPO→ARC与VMPO→PVH两条通路具有完全不同的温度感受特性。VMPO→ARC可能反映的是一种VMPO感受冷信息后,对ARC做出一种促进摄食行为的神经通路;而VMPO→PVH具有更为复杂的温度特性,可能反映的是VMPO对冷热信息的一种双向反应后,对PVH做出一种摄食行为的平衡调节。4、在前面环路逆行示踪的技术上,我们进一步结合钙离子活动指示剂Gcamp6m对自由活动小鼠在不同温度条件下,记录VMPO→ARC与VMPO→PVH两条通路的钙信号响应,更为精细的解析VMPO部位特异性投射至ARC与PVH的胞体的温度感受特性。我们在ARC与PVH部位注射逆行性重组酶AAVretro-cre,在VMPO部位注射cre依赖的AAV-DIO-Gcamp6m,通过光纤记录VMPO部位逆行性转染胞体上Gcamp6m的信号响应。我们分别在温度可控的金属板上(高温:40℃,常温:25℃,低温:10℃),以及恒温控制舱室内(高温:35℃,常温:25℃,低温:10℃)记录小鼠面临局部和全身性温度刺激下,VMPO部位钙信号活动。结果显示,VMPO→ARC与VMPO→PVH拥有两种完全不同的温度感受特性。VMPO→ARC在面临全身性冷刺激时会表现出明显的钙信号上升,而VMPO→PVH具有显著温度感受双向性,在面临全身性的热刺激时表现出明显的钙信号上升,在面临全身与局部冷刺激时表现出明显的钙信号下降。两条通路在面临局部温度刺激表现出较弱或者无明显的钙信号响应(VMPO→PVH通路对局部冷刺激除外),而仅在全身性环境温度刺激时才表现出大幅度的钙信号变化。VMPO→ARC与VMPO→PVH通路不同的温度感受特性可能是它们调控温度依赖性摄食行为的功能基础。总结上述结果,VMPO部位谷氨酸能神经元及其投射通路与温度依赖性摄食行为密切相关。VMPO作为温度感受与调控的重要区域,在感受全身性环境温度刺激后,通过谷氨酸能VMPO→ARC与VMPO→PVH投射通路对摄食行为进行适量调控。VMPO在温度依赖性摄食行为中的作用及其神经环路机制的解析,不仅有助于我们进一步加深对摄食与体温调控的关系认知,也有助于为临床发热性厌食的治疗提供新的切入点与理论依据。第二部分 高温环境下选择性注意障碍的静息态脑功能机制研究注意是一种重要的认知能力,良好的注意能力使大脑能够对客观信息和主观意识能够做出快速选择与反应。大脑通过知觉信息输入相关的视听信号,对外界繁杂冗余的信息进行快速的选择,将与自身关注密切相关的信息进行选择性的保留与加工,从而做出快速反应。注意网络时刻负责对外部环境事件进行高度警觉、监测与处理,并作出选择,但实际上,外部环境也会重塑我们大脑的注意活动。前人研究表明,注意网络的活动可以随时间、任务和认知状态而不断发生变化。然而,目前还不清楚人们的注意能力如何随着我们的生活环境的特性而变化,例如环境的温度。高温环境是很多职业场合中重要的危险因素和限制因素。在高热环境下,大脑对周围目标的警觉能力会降低。高温会增加大脑注意资源的耗竭速度,从而影响人类的行为表现。我们前期的研究表明,环境高温暴露下,大脑在执行持续性注意任务中,中枢疲劳程度增强,同时前额叶皮层补偿性的局部血流灌注被抑制。高温环境下,大脑注意功能的障碍,无疑会大大增加高温职业事故发生率。然而,高温环境下注意功能障碍的底层神经机制目前并没有得到很好的阐释。在前期的研究中,我们采用视空间注意网络测试范式揭示了高温环境下,人脑表现出选择性注意障碍,主要为对冲突性目标的执行控制能力下降,而对凸显性的、无预见性的刺激信息的警觉能力和朝向能力并无明显改变。然而,执行控制能力的下降可能并不是完全是由于任务过程中异常的脑激活所导致。在前人的报道中,即使在不执行任何认知任务时,大脑静息活动的基线状态即已发生改变,例如中枢疲劳程度的增加,这种大脑基线活动的变化,有可能造成在随后的任务执行中,行为能力的下降。然而,对于高温环境下注意网络内部静息态基线活动是否与我们前期研究发现的选择性注意障碍有关目前并不清楚。基于上述背景,在这一部分我们进行了以下实验:1、采用组独立成分分析(group independent component analysis,ICA)研究高温环境下注意网络内部静息态功能连接(functional connectivity,FC)的变化。我们采用3D动脉自旋标记技术(arterial spin labelling,ASL),对高温环境暴露下,大脑血流灌注(cerebral blood flow,CBF)图像进行采集,并与功能连接图像进行耦合分析,计算CBF-FC相关性、CBF/FC 比率等指标,进一步探究神经活动与血管反应的相关性。同时,采用多元线性回归分析方法对影像学指标与注意行为指标进行回归分析,进一步揭示静息态神经活动对注意行为的预测性。2、进一步采用独立成分分析方法提取高温暴露下默认模式网络(default mode network,DMN)与背侧注意网络(dorsal attention network,DAN)成分。对比分析 DMN与DAN在高温与常温下网络内功能连接变化情况。然后利用功能网络连接(functional network connectivity,FNC)技术计算DMN与DAN网络内与网络间成分功能连接变化情况,从而揭示同一种模态数据下DMN-DAN网络反相关系数的变化。并再次利用多元线性回归分析方法,探究DMN-DAN反相关系数与注意功能异常的相关性。主要结果与结论如下:1、通过多个神经影像指标(FC,CBF,CBF-FC相关性以及CBF/FC 比率)的联合分析,确证了高温环境下注意网络内静息态活动模式发生重构,主要表现为DAN功能活动显著降低,而腹侧注意网络(ventral attention network,VAN)活动显著增强。主要表现为:(1)CBF:高温环境下DAN网络内CBF表现出降低的区域,主要位于双侧顶内沟(intraparietal sulcus,IPS)与额叶视区(frontal eye field,FEF)区域。与之相反,高温环境下VAN网络内CBF表现出升高的趋势,尤其是在右侧腹部额叶皮层(ventral frontal cortex,VFC)区域;(2)CBF-FC相关性:发现高温环境下DAN网络内双侧FEF区域内CBF-FC相关性显著降低,而IPS区域内相关性保持不变。而VAN网络内,高温环境下VFC区域内CBF-FC相关性则表现为显著上升,颞顶联合区(temporal-parietal junction,TPJ)区域相关性保持不变;(3)CBF/FC 比率:DAN网络内,在左侧IPS区域内顶下叶附近,CBF/FC 比率显著上升,而在中央前回,中央后回等区域显著降低。而在VAN网络内,高温并未引起VAN网络内CBF/FC 比率显著变化。2、我们发现DMN网络前部区域内侧前额叶/扣带回前部(medial prefrontal cortex/anterior cingulate cortex,MPFC/ACC)网络内部功能连接降低与高温下执行控制能力障碍有关;网络间FNC分析揭示了DMN网络内独立成分20(independent component 20,IC20)成分(主要为MPFC/ACC区域)与DAN网络内IC14成分(主要为IPS区域)网络间功能连接降低与执行控制能力障碍有关,表明高温暴露下DMN与DAN之间固有的负相关关系变弱。上述结果意味着执行控制障碍与DMN网络内部功能连接的降低以及与DAN网络负相关关系变弱有关。而警觉能力在高温暴露下能够不受明显影响可能是由于DAN网络内部功能连接的代偿,尤其是FEF与IPS区域功能连接代偿性增强,造成行为学无明显异常。总结上述结果,本文揭示了高温环境下注意网络内静息态活动发生重构,主要表现为DAN区域内活动降低,而VAN区域内活动升高。而DAN与VAN内CBF、FC以及CBF-FC相关性的变化与注意行为的选择性障碍有关,表明注意行为的变化可能与高热环境下大脑静息态基线活动异常有关。在高温暴露下,DMN与DAN网络内与网络间功能连接的变化表明大脑对注意资源进行适应性重构以应对高温环境下注意资源的加速耗竭,优先满足对认知资源要求较低的刺激驱动型任务,例如警觉能力,从而造成对认知资源要求较高的任务出现障碍,例如执行控制能力。本文为高温环境下大脑功能障碍的神经机制提供了神经影像学证据,也为高温职业环境下作业任务的科学规划提供策略依据。