VEGF寡核苷酸转染对胃癌细胞SGC-7901生长增殖影响的研究

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目的研究转染血管内皮生长因子寡核苷酸(VEGF-ASODN)对胃癌细胞SGC-7901的影响,初步探讨转染VEGF和Survivin(生存素)在胃癌细胞SGC-7901中蛋白表达变化的关系,检测VEGFmRNA、VEGF蛋白的变化,同时检测Survivin蛋白、细胞凋亡率、细胞生存力和细胞生长等的变化;通过荷瘤裸鼠体内注射VEGF-ASODN或Survivin-ASODN,观察对移植瘤生长、血管生成以及血清VEGF表达水平等的影响。方法本实验研究的第一部分为体外实验部分,主要研究用血管内皮细胞生长因子反义寡核苷酸转染胃癌细胞SGC-7901对其生长的影响。用Real-Time PCR(RT-PCR)方法检测各组细胞VEGFmRNA的改变,用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测转染前后及对照组细胞、培养液VEGF蛋白水平的变化,并比较转染血管内皮细胞生长因子反义寡核苷酸和生存素反义寡核苷酸对培养液中VEGF蛋白水平的影响,同时用Western-blot方法测量转染VEGF-ASODN后细胞Survivin蛋白的变化,流式细胞仪检测转染VEGF-ASODN后细胞凋亡的变化,电子显微镜观察细胞凋亡形态学改变,绘制转染前后细胞生长曲线,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测转染对细胞生存力的影响。本实验研究的第二部分为动物实验,设对照组(无荷瘤),建立胃癌荷瘤裸鼠动物模型,随机分为四组:生理盐水组、VEGF组、Survivin组、错义组,进行瘤体、瘤周注射生理盐水、VEGF-ASODN、Survivin-ASODN或NODN,观察肿瘤生长情况,测量移植瘤体积和重量,用酶联免疫吸附方法测裸鼠体内血清VEGF蛋白改变情况,用免疫组化方法检测微血管生成情况,流式细胞仪检测PCNA表达。结果VEGF-ASODN转染胃癌细胞SGC-7901后,能显著降低其VEGFmRNA表达水平且呈浓度依赖性,降低培养液中VEGF蛋白含量和细胞内VEGF蛋白含量,呈浓度依赖性,还能降低细胞Survivin蛋白含量,也呈浓度依赖性,使细胞生长受到抑制、细胞生存力下降、细胞凋亡明显增加、电镜下可见细胞凋亡形态学改变,分别转染VEGF-ASODN和Survivin-ASODN都能降低培养液中VEGF蛋白含量。瘤体、瘤周注射VEGF-ASODN、Survivin-ASODN检测其血清中的VEGF证明均能降低胃癌细胞VEGF的表达、抑制移植瘤生长、使肿瘤微血管生成减少,VEGF-ASODN、Survivin-ASODN治疗使移植瘤PCNA表达降低。结论实验结果显示VEGF-ASODN不仅能降低胃癌细胞SGC-7901VEGFmRNA的拷贝数、降低VEGF蛋白的表达、抑制移植瘤血管生长、降低裸鼠体内血清VEGF蛋白水平、降低PCNA表达,还能降低Survivin蛋白的表达、降低细胞的生存力、诱导细胞凋亡、抑制移植瘤生长;Survivin-ASODN也能降低VEGF蛋白的表达、抑制移植瘤血管生长、降低裸鼠体内血清VEGF蛋白水平、抑制移植瘤生长、降低PCNA表达。本研究结果提示反义寡核苷酸技术在胃癌的特异性治疗方面也许有良好的应用前景。
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