论文部分内容阅读
安全高效的基因传输载体是实现基因治疗的关键之一。阳离子聚合物易于合成和改性、无免疫原性等优点使其成为非病毒基因载体的一种重要类型；但由于其对细胞有正电荷相关的毒性、转染效率较病毒载体低、缺乏传输特异性、尤其在体内缺乏有效的手段检测靶向传输机制等缺点制约了其在临床上的应用。本论文从提高基因靶向转染效率和确定靶向传输机制出发，合成了叶酸偶联聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺(FA-PEG-PEI)、单甲基醚聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺(PEG-PEI)、聚己内酯接枝支化聚乙烯亚胺(PCL-g-hy-PEI)、硬脂酸接枝聚乙二醇-线性聚乙烯亚胺(SA-g-PEG-lPEI)以及单分散纳米Fe304(SPIO)；利用<1>HNMR、FT-IR、GPC表征聚合物；TEM、XRD表征了SPIO，磁学检测表明其呈现超顺磁性。以FA-PEG-PEI复合质粒DNA(pDNA)在体外进行了靶向传输及转染实验。PCL-g-hy-PEI与SA-g-PEG-lPEI同时负载SPIO和基因后，可作为潜在核磁共振显像(MRI)可见的基因传输双功能载体。
FA-PEG-PEI与PEG-PEI复合pDNA后进行电位、粒度分析表明其带正电，粒径在200～300nm，琼脂糖凝胶电泳实验表明在N/P值为5和10能够完全阻滞。以hy-PEI(25kDa)与Lipofectamine2000为对照。FA-PEG-PEI、PEG-PEI复合编码荧光光素酶的pGL3-pEINA与编码绿色荧光蛋白的pAV-EGFP-pDNA对C6、293T与HepG2细胞进行了体外转染，分别利用荧光素酶报告基因检测和荧光显微镜考察了其转染效果，MTT实验考察了复合物的毒性，实验结果表明和另外三种复合物相比，FA-PEG-PEI/pDNA在表达叶酸受体的C6与293T细胞中转染后表达的荧光素酶水平高，荧光显微镜下观测到的荧光强度也高；FA-PEG-PEI对C6与HepG2细胞毒性较小，FA-PEG-PEI对293T细胞毒性比PEl25kDa、LiDofectamine2000小而比PEG-PEI/大，表明FA-PEG-PEI能够作为C6细胞的叶酸介导靶向载体且细胞毒性小。不同组成的PCL-g-hy-PEI与SA-g-PEG-lPEI通过O/W乳化发分别包裹SPIO，TEM观测PCL-g-hy-PEI包裹SPIO样或者空白样形貌呈胶束状，而SA-g-PEG-IPEI包裹SPIO样与空白样都成囊泡状。动态光散射(DLS)粒度分析表明两种聚合物自组装空白样与包裹SPIO样品粒径都在150nm左右，包裹SPIO后粒径有所增大。PCL-g-hy-PEI空白样zeta．电位在+35mv左右，SA-g-PEG-lPEI为+12mv左右，包裹SPIO后都有一定的降低。磁学性质表明两种共聚物包裹SPIO后的纳米粒子仍呈现出超顺磁性。
FA-PEG-PEI/pDNA对C6，293T细胞的转染特性表明FA-PEG-PEI能够作为两种细胞的靶向基因传输载体；PCL-g-by．PEI与SA-g-PEG-lPEI包裹SPIO后表现出的超顺磁性和正电性使其能够作为潜在的MRJ可见的基因传输双功能载体。