天蚕素是发现最早，研究最多的一类抗菌肽，具有抗菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞及免疫调节活性，对高等动物机体的正常细胞无损伤。目前认为天蚕素的主要作用靶点为细胞膜，它能在细胞膜上形成孔道，造成细胞膜结构破坏，导致细胞死亡。人溶菌酶是存在于正常体液和组织中的一类非特异性免疫因子，可以破坏细胞壁中的 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4 糖苷键，导致细胞壁溶解，因而具有较强的杀菌活性尤其是对革兰阳性菌，但对人体没有毒副作用。研究发现天蚕素与溶菌酶之间存在着协同作用，推测可能是天蚕素破坏细菌外膜后利于溶菌酶作用于细胞壁。基于天蚕素和溶菌酶显示出的优良的抗菌活性及其独特的作用机制，在当前许多抗生素产生抗药性、开发新型抗生素困难的形势下，对其进行研究具有重要现实意义。本课题选取家蝇来源的抗菌肽天蚕素 (Musca domestica cecropin，Mdc)和人体来源的溶菌酶 (Human lysozyme，Hly)，采用重叠延伸 PCR (SOE-PCR)技术构建 Mdc-hly 融合基因，通过原核表达系统 pET-32a 表达，并对该基因表达产物的抗菌活性及其作用机制进行初步探讨，为能开发一种广谱高效的新型抗菌多肽类药物奠定基础。　　 实验方法：　　 1.Musca domestica cecropin (Mdc)和Human lysozyme (Hly)基因的克隆：采用TRIzol 试剂一步法，分别从家蝇三龄幼虫和人胎盘组织中提取总RNA，RT-PCR扩增出 Musca domestica cecropin和 Human lysozyme基因的编码区序列，将目的片段分别克隆入pMD20-T载体，进行PCR、酶切、测序鉴定。　　 2.融合基因Mdc-hly的构建及生物信息学分析：以Mdc/pMD20-T和Hly/pMD20-T 重组质粒为模板，设计两对特异性引物，运用SOE-PCR技术将两段基因通过疏水性Linker序列进行体外基因重组，构建融合基因Mdc-hly。将融合基因克隆入pMD20-T载体，进行PCR、酶切、测序鉴定，并运用相关生物信息学软件对融合蛋白的物理化学性质、功能域、疏水性、蛋白质二级结构和三级结构进行预测分析。　　 3.融合基因Mdc-hly原核表达、纯化和鉴定：用相同的限制性内切酶对重组质粒 Mdc-hly/pMD20-T和原核表达载体 pET-32a分别进行酶切并连接，构建原核重组表达质粒，转化Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达并对表达条件进行优化。采用SDS-PAGE、Western Blot方法对表达产物进行分析鉴定。表达的目的蛋白Trx-6His-Mdc-hly经亲和色谱纯化、透析复性后用Enterokinase酶切去除Trx-6His标签蛋白。　　 4.融合蛋白的抗菌活性及其作用机制初步研究：采用微量肉汤稀释法分别测定Mdc、Hly、Mdc-hly对多种常见革兰阳性菌和革兰阴性菌标准菌株的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。并以 Escherichia coli和 Staphylococcus aureus为研究对象，应用扫描电子显微镜、透射电子显微镜技术观察Mdc、Hly、Mdc-hly作用后以上两种菌的外部形态和内部超微结构变化。　　 实验结果：　　 1.Musca domestica cecropin (Mdc)和 Human lysozyme (Hly)基因的克隆：以家蝇三龄幼虫和人胎盘组织中提取的总RNA为模板，经RT-PCR分别扩增得到约 140 bp的 Musca domestica cecropin和约 410 bp的 Human lysozyme的成熟肽基因，将其分别克隆入 pMD20-T 载体，经PCR、酶切、测序鉴定，结果表明：所获得 Musca domestica cecropin和 Human lysozyme 成熟肽的基因序列与 GenBank 公布序列完全一致。　　 2.融合基因Mdc-hly的构建及生物信息学分析：采用SOE-PCR技术将两段基因通过疏水性Linker序列进行体外基因重组，扩增得到约580 bp的融合基因片断。序列分析表明融合基因中Mdc、Hly和Linker序列、拼接组合的顺序及方向完全正确。生物信息学分析Mdc-hly为阳离子蛋白，具有疏水性，分子量20131.7 Da，理论等电点9.69，结构稳定，利于基因工程表达，含有Musca domestica cecropin和Human lysozyme蛋白的保守结构域，二级结构主要由α-螺旋、β-转角和无规则卷曲组成。　　 3.融合基因Mdc-hly原核表达、纯化和鉴定：将融合基因Mdc-hly亚克隆入原核表达载体pET-32a，经PCR、酶切、测序鉴定后，成功构建了重组原核表达质粒Mdc-hly/pET-32a。将Mdc-hly/pET-32a转化大肠杆菌，利用IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE、Western Blot分析鉴定为目的蛋白Trx-6His-Mdc-hly。目的蛋白Trx-6His-Mdc-hly经亲和色谱纯化、透析复性后用Enterokinase酶切去除Trx-6His标签蛋白。最终，每升发酵菌液得到融合蛋白Mdc-hly约21.4 mg。　　 4.融合蛋白的抗菌活性及其作用机制初步研究：抑菌实验结果表明：Mdc对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性，但对革兰阴性菌的活性明显强于对革兰阳性菌；Hly主要杀灭革兰阳性菌，对革兰阴性菌作用效果不明显；融合蛋白Mdc-hly对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性，比其亲本蛋白Mdc、Hly的抗菌谱更广，活性也有所提高。扫描电子显微镜结果显示：Mdc作用后菌细胞表面出现明显的细胞膜脱离；Hly作用后可见菌体发生变形，细胞表面出现明显的细胞壁损伤；而融合蛋白Mdc-hly作用后可见菌细胞崩解、断裂死亡后的残体。透射电子显微镜结果显示：Mdc作用后，细菌细胞外膜脱离，细胞质分布不均，胞核固缩较严重；Hly作用后可见胞壁外形不平、边缘粗糙，部分细胞壁模糊不清；融合蛋白Mdc-hly作用后可见细胞外膜脱离、细胞壁溶解，菌体断裂，细胞质固缩、分布不均，胞浆内物质外漏。说明Mdc可能同典型的cecropin类抗菌肽一样主要作用于细菌细胞膜，Hly主要作用于细菌细胞壁，而融合蛋白Mdc-hly可能兼具Mdc、Hly二者特点，对细菌的细胞壁和细胞膜均有作用。　　 结论：　　 本研究分别从家蝇幼虫和人胎盘组织中提取总RNA，进行RT-PCR，获得与GenBank公布序列一致的Mdc和Hly两个基因的成熟肽序列。采用SOE-PCR技术利用一段疏水性Linker序列将二者拼接构建融合基因Mdc-hly。运用生物信息学软件对融合基因Mdc-hly推导的氨基酸序列进行预测分析，结果显示其含有Musca domestica cecropin和Human lysozyme蛋白的保守结构域并具有保证抗菌蛋白生物活性所应有的物理化学结构特点。将融合基因Mdc-hly亚克隆入原核表达质粒pET-32a，成功构建了重组原核表达质粒Mdc-hly/pET-32a，转化大肠杆菌后，用IPTG诱导表达，经超声破菌提取菌体蛋白，依次进行亲和色谱纯化，Enterokinase酶切去除标签蛋白等多个步骤，获得了重组的融合蛋白Mdc-hly。体外检测融合蛋白的抗菌活性，发现此蛋白对多种常见细菌标准菌株均有明显的抑菌效应，比其亲本蛋白的抗菌谱更广，且活性有所增强。利用扫描电镜和透射电镜技术，进一步对其杀菌机制进行探讨，发现融合蛋白综合了其亲本蛋白二者的特点，不仅对细菌细胞膜有作用，同时也能溶解细胞壁。这为开发一种新型抗菌多肽类药物奠定了一定的实验基础，也为抗菌蛋白或其它功能性多肽的重组表达提供了借鉴意义。