论文部分内容阅读
研究目的 糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)心血管并发症的重要组成部分,也是DM患者死亡的主要原因。本课题旨在研究DCM发生发展过程中大鼠心肌Wnt/β-catenin信号通路的变化规律及其调控机制,完善DCM的病理生理机制,为DCM的治疗寻找新的治疗靶点和新药开发目标。研究方法 1.模型建立、实验分组及样本收集1型糖尿病大鼠模型的建立采用一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ) 60mg/kg,以72h后空腹血糖值(fasting blood glucose, FBG)≥ 16.7 mmol/L,并出现多饮、多食、多尿和体重下降者为DM模型成功。按体重均衡的原则随机将非糖尿病组(non-diabetic, ND)大鼠和造模成功的DM组大鼠各分为2,4,8和12周四组,每组≥10只。分别在2,4,8和12周时测FBG,称体重(body weight, BW),麻醉后腹主动脉取血,迅速取出心脏并剔除血管、脂肪等非心肌组织,称心脏及左心室重量(heart weight, HW; left ventricular weight, LVW),并计算心脏指数(cardiac index, CI, HW/BW)及左心室质量指数(left ventricular weight index, LVWI, LVW/BW)。分离的左心室一部分于10%甲醛溶液中固定,另一部分于液氮中保存待用。2.2周糖尿病大鼠病理观察及指标检测HE染色法观察2周大鼠心肌组织病理改变；免疫组织化学法(immunohistochemical,IHC)和Western blotting (WB)检测2周大鼠心肌Wnt2, β-catenin, c-Myc和DKK1的蛋白表达变化。3.4,8,12周糖尿病大鼠病理观察及指标检测ELISA法检测空腹血浆胰岛素水平；HE及Masson三色染色法观察大鼠心肌组织病理改变；TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡水平的变化；WB及IHC法检测心肌组织中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达变化；qRT-PCR检测心肌组织中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白mRNA的表达变化。实验结果 1.糖尿病大鼠一般状况及病理组织学改变与ND组比较,DM组大鼠逐渐出现多饮、多食、多尿和消瘦,精神萎靡,皮毛无光泽,腥臊酮臭味加重、稀便等。DM组大鼠FBG明显升高,FINS水平、HW及LVW均明显降低,CI及LVWI均高于ND组。HE结果显示2周DM组大鼠心肌出现局灶性心肌细胞变性、坏死,但未观察到明显的心肌肥大。4,8,12周时DM组大鼠心肌胶原沉积面积持续性升高,心肌细胞横截面面积明显高于ND组,表明心肌纤维化及心肌肥大的出现；TUNEL结果显示,4,8,12周时DM组大鼠心肌细胞凋亡率明显升高,并呈时间依赖性。2.2周糖尿病大鼠心肌Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达WB实验结果表明,2周DM大鼠心肌中Wnt2、β-catenin和c-Myc蛋白的表达相对于ND组明显增加(P<0.01),但DKKl的表达变化不明显。IHC结果显示,ND组大鼠心肌中各蛋白表达均匀分布,DM组大鼠心肌中Wnt2、β-catenin和c-Myc的表达均明显增加,其中P-catenin伴随少量核表达,c-Myc在细胞质和细胞核中表达均增加。3.4,8,12周糖尿病大鼠心肌Wnt/p-catenin信号通路相关蛋白及其mRNA的表达实验结果显示DM心肌中Wnt2,β-catenin和c-Myc的表达在4,8,12周时随着DCM的发展逐渐增加(P<0.01),其mRNA水平也逐渐增加(P<0.05),而TCF4及其mRNA水平仅在8周和12周时表达高于ND组(P<0.01)。其中,β-catenin在4周DM心肌中表达增加,并开始进入细胞核,在8周和12周时,其细胞核表达逐渐增加并伴随细胞质中表达的减少(P<0.01)；而c-Myc在细胞核和细胞质中的表达随着DCM的发展均逐渐增加(P<0.01)。DKK1及其mRNA的水平在4周DM心肌中表达明显高于ND组,随后随着信号通路的激活在8周和12周时表达显著性降低但仍高于ND组(P<0.01)。此外,P-GSK3β(Ser9)在4周DM大鼠心肌中表达无明显增加,但在8周和12周时其表达逐渐增加,并伴随GSK3β mRNA水平的降低(P<0.01)。结论 1.STZ诱导的大鼠成模后,心肌凋亡细胞增加,伴随明显的心肌细胞坏死、心肌肥大和心肌纤维化等心肌损伤。2.DM心肌中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白及mRNA的水平随DCM的发生发展呈不同程度的增加,表明DM诱导Wnt/β-catenin信号通路的激活。3. Wnt/β-catenin信号通路的激活参与DCM的发生发展过程,开发该信号通路的特异性抑制剂将给DCM患者带来福音。