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恶性肿瘤严重危害人们的生命和健康,传统的治疗方式是手术、化疗和放疗,对中晚期恶性肿瘤疗效欠佳。阻断肿瘤血管生成的治疗是肿瘤治疗中的新思路。肿瘤血管可以表达特异性蛋白,它们只存在于肿瘤血管,寻找肿瘤血管特异表达分子从而进行特异性肿瘤血管治疗具有十分重要的意义。我们利用噬菌体体内筛选技术,通过建立CTX免疫抑制Balb/c小鼠人胃癌移植瘤模型,成功筛选出能与胃癌血管特异性结合的环状小肽GX1,并进行了初步鉴定。该肽段可以同胃癌血管特异性结合,空间结构相对稳定。进一步用放射性核素标记该小肽, ECT结果显示:标记小肽能够靶向到胃癌荷瘤小鼠的肿瘤组织;肿瘤组织的放射性高于对照组织。体内外实验显示该小肽具备作为抗原结合表位的特点,有可能成为肿瘤血管靶向治疗的特异性多肽。人肿瘤坏死因子(TNFα)是迄今为止人们发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子。但目前天然TNFα仅限于局部使用治疗肢体软组织肉瘤,破坏肿瘤血管内皮细胞,改变内皮细胞的屏障功能。重组改构的人肿瘤坏死因子(rmhTNFα)具有高效低毒的优点,在我国已批准上市治疗小细胞肺癌,但由于需较大的剂量,目前主要作为协同化疗药在临床使用。为了进一步提高rmhTNFα的疗效,降低毒副作用同时降低用量,我们采用基因工程的方法,将GX1肽融合在rmhTNFα的N末端,构建了GX1-rmhTNFα,旨在使该融合蛋白通过GX1小肽与胃癌新生血管靶点的结合,既能使rmhTNFα在胃癌组织的新生血管处富集,针对性地发挥它的抑制胃癌血管形成和抗肿瘤作用,又能改变血管内皮细胞的屏障功能,进一步降低用药量和全身的毒副作用。本论文研究如下:1.GX1-rmhTNFα的表达和纯化采用DNA重组技术,成功构建了含GX1-rmhTNFα融合基因的原核表达载体pBV-220-GX1-rmhTNFα,含有该表达载体的工程菌经温度诱导后表达量占菌体可染蛋白的7%左右,超声裂菌后SDS-PAGE显示上清和沉淀都有表达,新生的蛋白条带能够和抗人TNFα单抗特异性结合。对重组工程菌裂菌上清进行固体硫酸铵盐析,SP-Sepharose Fast Flow column和Q -sepharose Fast Flowcolumn层析纯化,获得纯度>95%的重组蛋白,活性为5.65×108 IU/ml。2.GX1-rmhTNFα的生物学活性鉴定用裸鼠皮下种植胃癌SGC7901细胞成瘤动物模型观察GX1-rmhTNFα的体内分布情况,ELISA检测组织上清TNFα显示目的蛋白GX1-rmhTNFα比对照蛋白rmhTNFα更能靶向结合于胃癌组织,注射后2h是对照组织的3.84倍。进一步将GX1-rmhTNFα和rmhTNFα用放射性核素标记,SPECT显像提示在18h见肿瘤部位GX1-rmhTNFα浓集,而rmhTNFα组未见明显浓集现象。给予GX1-rmhTNFα及对照药物治疗,观察肿瘤生长大小及裸鼠体重变化情况,结果显示GX1-rmhTNFα从注射13天起出现抑制肿瘤的生长,于15天开始,GX1-rmhTNFα组肿瘤组织明显小于rmhTNFα组。与其它对照药物相比,其全身毒副作用明显降低。3.GX1-rmhTNFα的作用机制研究为了确定GX1-rmhTNFα能够靶向入胃癌血管,将相同剂量的GX1-rmhTNFα和rmhTNFα经尾静脉注射入荷瘤裸鼠体内,经循环10min、30min、2h、12h和24h后,取出肿瘤组织,固定切片。对切片进行抗TNFα单抗免疫组化染色,发现GX1-rmhTNFα组与rmhTNFα组相比,在肿瘤组织中聚集更多。进一步用免疫荧光共定位的方法证实GX1-rmhTNFα在胃癌血管上有聚集。伊文蓝渗透实验显示GX1-rmhTNFα组与rmhTNFα组相比,有更多的伊文蓝渗透入肿瘤组织。MTT实验进一步显示在HUVEC细胞上,GX1-rmhTNFα比rmhTNFα引起更多的细胞死亡,而在SGC7901细胞上,两组无差别。流式细胞术证实GX1-rmhTNFα能引起更多HUVEC细胞凋亡,而对其细胞周期无影响。综上所述,我们稳定高效地表达纯化了GX1-rmhTNFα。体内外实验均证实,与rmhTNFα相比,GX1-rmhTNFα是一种高效低毒的抗胃癌新生血管形成的药物。通过体内分布及对其作用机制的研究,发现GX1-rmhTNFα能够靶向入荷瘤裸鼠肿瘤血管内皮上,引起肿瘤血管内皮细胞凋亡,从而增加肿瘤血管间隙,使更多的药物进入肿瘤组织,抑制肿瘤生长。本研究结果为GX1-rmhTNFα重组蛋白的工业化生产和全面临床前试验奠定了基础。