研究背景:原发性肝癌是人类最常见的消化道实体肿瘤之一,肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)约占原发性肝癌病例的70-90%,具有极高的侵袭性和转移率,然而,HCC恶性进展的分子机制尚未完全明了。精子相关蛋白5(Sperm-associated antigen 5,SPAG5)在纺锤体组装和染色体分离中发挥重要作用,从而调控细胞分裂。在多种恶性肿瘤中可见表达升高,且与患者预后差相关。上调SPAG5可以影响肿瘤细胞对化疗的敏感性。然而,SPAG5在HCC中的作用及其机制尚未明了。miR-363-3p可能是SPAG5的一个上游调控microRNA,进而抑制HCC发生发展。与SPAG5共表达的基因中包括中心体相关蛋白(centrosomal protein 55,CEP55),主要通过调控中心体复制参与细胞分裂。CEP55参与肿瘤恶性进展,在HCC细胞中,CEP55通过AKT/PI3K信号通路促进细胞增殖。因此,研究miR-363-3p/SPAG5/CEP55信号轴在HCC恶性进展中的作用,有助于阐明HCC浸润转移的调控机理、制定HCC治疗新策略,具有重大的临床意义。研究方法:一、临床标本的获取HCC患者石蜡包埋标本:收集了2010年1月至2014年12月在南昌大学第一附属医院和中山大学附属肿瘤医院进行手术的298例HCC患者石蜡标本,并且另外收集了同期93例有静脉转移的HCC样本。样本均进行甲醛固定和石蜡包埋。新鲜组织的收集:收集了27例新鲜HCC组织及其相应的癌旁组织,用于肿瘤相关分子的mRNA及蛋白的表达量检测。组织标本切除离体后,立即放置于-80℃冰箱中长期保存。术前患者均未接受过化疗、放疗、介入治疗,靶向治疗或免疫治疗。标本均匿名。所有标本的来源和处理流程均符合南昌大学第一附属医院和中山大学附属肿瘤医院的医学伦理委员会要求。二、临床病理参数分析及统计分析采用HE染色和IHC显色法,检测石蜡组织中SPAG5蛋白的表达情况。染色结果由病理科医师判读及记录。两组数据之间的比较和统计采用两独立样本的t检验。χ~2检验用于SPAG5表达与临床资料相关性的统计分析。生存分析采用Kaplan-Meier方法。Cox分析用于单因素分析。所有统计分析均采用SPSS 19.0软件。三、体内及体外生物学实验方法利用PCR及Western Blot实验方法,在临床组织标本及细胞株中检测SPAG5、miR-363-3p及CEP55相关RNA和蛋白的表达情况。MTT、EDU和Transwell等实验用于检测细胞增殖和迁移的能力。双荧光素酶报告基因系统用于检测目的基因启动子或3’UTR区域的转录活性。体内动物实验采取裸鼠皮下成瘤模型及尾静脉注射肺转移成瘤模型,在肿瘤的生长过程中不断监测肿瘤的体积和大小,并用IHC检测SPAG5、ki67等蛋白的表达。研究结果:临床数据分析提示,HCC中SPAG5表达增加并与肝癌预后不良相关。体外和体内实验表明,过表达SPAG5促进肝癌细胞增殖和迁移,miR-363-3p通过抑制SPAG5 mRNA的3’UTR活性降低了SPAG5蛋白的表达,从而明显抑制了细胞的生长和迁移,而这一过程可被SPAG5的过表达抵消,miR-363-3p是肝癌细胞中SPAG5表达的上游抑制性调节因子,SPAG5是miR-363-3P在肝癌中的靶点。在临床样本中观察到SPAG5表达与CEP55表达呈正相关,高SPAG5的肝癌患者常伴有CEP55的高表达。在肝癌细胞系中,SPAG5和CEP55在细胞浆中共定位,CEP55的敲除显著减弱了SPAG5促进细胞增殖和迁移,说明SPAG5在HCC中与CEP55相互作用,且SPAG5的过表达及其促进细胞增殖和迁移的能力与Ser473位点的AKT磷酸化水平相关,提示在SPAG5与CEP55相互作用的过程中触发了肝细胞肝癌PI3K/AKT信号通路。研究结论:SPAG5在肝细胞癌中的表达增加与不良预后密切相关,SPAG5在肝细胞癌中是一个有前景的预后因素。SPAG5通过CEP55介导的PI3K/AKT途径作为癌基因发挥作用。新发现的miR-363-3P/SPAG5/CEP55是肝癌临床干预的潜在治疗靶点。