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海藻糖是广泛存在于生物中的一种非还原性二糖,其理化性质稳定,在各物种中均有增强胁迫耐受性的报道。高温胁迫是糙皮侧耳农业式栽培不可避免的环境因素,研究热胁迫下糙皮侧耳的海藻糖代谢对于农业生产具有深远的意义。本研究包括以下四个方面:(1)将糙皮侧耳 6-磷酸海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase from Pleurotusostreatus,PoTPS1)基因原核表达,并检测纯化后蛋白的酶动力学参数,得到PoTPS1蛋白的酶动力学参数如下:Km(G6P)为 0.14 mM,Km(UDPG)为 0.17 mM,Kca为 5.89 s-1 Vmax 为 91.86 nKat.g-1;其次,该酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为7.4;另外,对热胁迫下糙皮侧耳胞内海藻糖含量的检测发现,40℃热处理15 h后海藻糖的积累最高,为158.88 mg.g-1干菌丝,此时PoTPS1酶活最高,海藻糖降解酶酶活最低,进一步验证了糙皮侧耳中TPS-TPP海藻糖合成途径。(2)在糙皮侧耳中构建了农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium tumies-mediated transformation,ATMT)体系:用糙皮侧耳的GPD启动子替代原载体pGL-GPD中的GPD启动子,并命名为Po-gpdOE。优化了四组转化条件,得到最优转化条件为:农杆菌菌株为LBA4404,农杆菌和原生质体的数量比为100:1,乙酰丁香酮(Acetosyringone,AS)的浓度为0.1 mM,农杆菌与原生质体共孵育时间为18 h;Southern blot实验证实,载体中的HPH基因已整合进糙皮侧耳的基因组;荧光显微镜检测EGFP的表达发现,转化子中有EGFP的表达;转化子有丝分裂稳定性检测发现,超过75%的转化子连续传代培养5代以后仍能保留对潮霉素的抗性,以上结果共同证实了该遗传转化体系的可行性。(3)热胁迫对糙皮侧耳菌丝的生长有严重的影响,热胁迫一段时间后恢复生长能形成明显的热激后生长圈;添加H202能严重影响菌丝的生长,而在热胁迫的同时添加活性氧(Reactive oxygen species,ROS)清除剂 N-乙酸半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)和维生素 C(VitaminC,VC)后生长得到了部分恢复;对以上不同处理条件下胞内海藻糖含量的检测发现,添加2 mM和8 mM H2O2后胞内海藻糖含量分别提升至117.01和130.15 mg.g-1干菌丝,而在热胁迫的同时添加ROS清除剂2 mM NAC和8 mM VC后海藻糖含量分别回复至85.86和89.23 mg.g-1干菌丝;以上结果表明热胁迫下糙皮侧耳胞内积累的ROS 一方面造成了菌丝的生长损伤,另一方面参与诱导糙皮侧耳胞内海藻糖的合成。(4)另外,本研究探索了海藻糖对糙皮侧耳的保护作用:热胁迫下外源添加海藻糖可促进糙皮侧耳菌丝热胁迫后的恢复生长;通过ATMT构建PoTPS1及糙皮侧耳中性海藻糖酶(Neutral trehalase fromPleurotus ostreafus,PoNTH)的过表达转化子 OE::TPS1 和 OE::NTH,在热胁迫条件下,OE::TPS1-5和OE::TPS1-9内源海藻糖含量增加了 13.60%和13.42%,OE::NTH-2和 OE::NTH-6 内源海藻糖含量减少了 43.07%和 45.06%;OE::TPS1-5 和 OE::TPS1-9 菌丝热胁迫后的恢复生长有一定的促进,而OE::NTH-2和OE::NTH-6菌丝热胁迫后的恢复生长与WT相比受到进一步的抑制;以上结果说明热胁迫下胞内积累的海藻糖能一定程度上缓解热胁迫对菌丝造成的损伤。