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背景：
卵巢癌是全球女性最常见的生殖系统肿瘤之一，也是致死率最高的妇科疾病之一。2016年，中国女性将近有30万例卵巢癌新发病例以及近10万死亡病例。大多数卵巢癌患者最终死于肿瘤的转移和复发，因此对于卵巢癌转移机制的研究至关重要。在卵巢癌临床标本和卵巢癌细胞系中发现Gab2过表达，而且在体外实验中，Gab2通过PI3K途径来促进卵巢癌细胞的迁移、侵袭和上皮间充质转化（EMT)。MicroRNAs(miRNA)可以通过调控EMT，在原发性肿瘤干细胞样特性细胞的生成和转移的过程中发挥重要作用。miR-200c可以通过直接靶向Zeb1来抑制EMT和卵巢癌转移，起到抑癌作用。可是，Gab2/PI3K是否通过抑制miR-200c来促进卵巢癌细胞的转移性生长尚未报道。
目的：
为了研究Gab2在卵巢癌转移性生长中的作用机制，为卵巢癌转移的发生发展机制提供理论意义，我们首先探讨了Gab2在体内实验中对于卵巢癌转移性生长的影响，其次探讨了卵巢癌细胞株中Gab2如何通过调控miR-200c来影响卵巢癌干细胞样特性细胞的迁移和侵袭能力。
方法：
1.用逆转录病毒载体在卵巢癌细胞株（OVCAR5和OVCAR8）中高表达Gab2。
2.检测Gab2高表对卵巢癌肿瘤干细胞特性的影响：1）利用流式细胞仪技术检测细胞中ALDH+细胞群的数量。2）观察卵巢癌细胞形成肿瘤微球体能力的变化情况。
3.卵巢癌成瘤模型的建立：用稳转有Luciferase-GFP基因的卵巢癌细胞OVCAR5（vector组和Gab2高表组）腹腔注射入nu/nu裸鼠中。用小鼠活体成像仪来观察两组卵巢癌细胞在裸鼠腹腔中转移性生长的能力。
4.检测Gab2高表对卵巢癌细胞中miR-200c表达的影响情况：采用TRIZOL试剂提取细胞总RNA，利用实时荧光定量PCR技术检测miR-200c的表达情况。
5.经PI3K抑制剂GDC-0941处理以后，利用实时荧光定量PCR技术检测vector组和Gab2高表组卵巢癌细胞中miR-200c的表达情况。
6.经miR-200c模拟体（mimic）处理以后，检测vector组和Gab2高表组卵巢癌细胞中的EMT标志物蛋白的表达影响：利用westernblot技术检测卵巢癌细胞中P-AKT，E-cadherin，CD44的表达情况。
7.经miR-200cmimic处理以后，检测vector组和Gab2高表组卵巢癌细胞的功能变化情况：细胞分为三组：vector+miR-con组，Gab2+miR-con组，Gab2+miR-200c组。功能试验包括tranwell细胞迁移和侵袭，肿瘤微球体形成实验。
8.经miR-200cmimic处理以后，检测卵巢癌细胞中的肿瘤干细胞标志物的变化情况：细胞分为三组：vector+miR-con组，Gab2+miR-con组，Gab2+miR-200c组。利用流式细胞仪技术检测卵巢癌细胞中的ALDH+细胞群数量和检测肿瘤微球体形成效率。
9.经siRNA-CD44处理以后，检测vector组和Gab2高表组卵巢癌细胞迁移和侵袭能力的变化情况：细胞分为三组：vector+siRNA-con组，Gab2+siRNA-con组，Gab2+siRNA-CD44组。
结果：
1.Gab2高表促进卵巢癌细胞中ALDH+细胞群的数量上升，并且卵巢癌成球实验形成的微球体个数增加。
2.Gab2高表促进卵巢癌细胞在裸鼠腹腔中转移性生长的能力增强。
3.Gab2高表抑制miR-200c在卵巢癌细胞中的表达。
4.Gab2高表卵巢癌细胞中加入PI3K抑制剂GDC0941后，其miR-200c的表达量升高。
5.Gab2高表的卵巢癌细胞经过miR-200cmimic处理以后，与对照miRNA处理相比，E-cadherin的表达量升高，CD44的表达量降低。
6.Gab2高表的卵巢癌细胞经过miR-200cmimic处理以后，与对照miRNA处理相比，其迁移和侵袭能力下降。
7.Gab2高表的卵巢癌细胞经过miR-200cmimic处理以后，与对照miRNA处理相比，卵巢癌细胞中ALDH+细胞群的数量减少，并且卵巢癌细胞成球个数也减少。
8.Gab2高表的卵巢癌细胞经过siRNA-CD44处理以后，与siRNA-对照相比，其迁移和侵袭能力降低。
结论：
在本研究中，我们利用流式细胞技术和癌细胞微球体形成实验分析检测了Gab2的表达对卵巢癌肿瘤干细胞生长特性的影响。在两种不同的卵巢癌细胞系OVCAR5和OVCAR8中，我们发现Gab2可以增加ALDH+细胞的数量和促进癌细胞微球体的形成。此外，Gab2可以促进OVCAR5细胞在裸鼠中的转移性生长。从机制上，我们发现Gab2可以通过激活PI3K从而特异性地抑制miR-200c的表达。Gab2通过下调miR-200c来促进卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力，EMT特性以及ALDH+细胞的扩增和癌细胞微球体的形成。此外，Gab2通过miR-200c下调促进CD44表达和细胞迁移/侵袭。我们的发现支持了一个模型，即Gab2-PI3K通路通过下调miR-200c来促进CD44表达、EMT特征和卵巢癌干细胞样细胞生长。涉及miR-200c或靶向CD44的疗法可能有助于治疗Gab2过表达的卵巢癌。
卵巢癌是全球女性最常见的生殖系统肿瘤之一，也是致死率最高的妇科疾病之一。2016年，中国女性将近有30万例卵巢癌新发病例以及近10万死亡病例。大多数卵巢癌患者最终死于肿瘤的转移和复发，因此对于卵巢癌转移机制的研究至关重要。在卵巢癌临床标本和卵巢癌细胞系中发现Gab2过表达，而且在体外实验中，Gab2通过PI3K途径来促进卵巢癌细胞的迁移、侵袭和上皮间充质转化（EMT)。MicroRNAs(miRNA)可以通过调控EMT，在原发性肿瘤干细胞样特性细胞的生成和转移的过程中发挥重要作用。miR-200c可以通过直接靶向Zeb1来抑制EMT和卵巢癌转移，起到抑癌作用。可是，Gab2/PI3K是否通过抑制miR-200c来促进卵巢癌细胞的转移性生长尚未报道。
目的：
为了研究Gab2在卵巢癌转移性生长中的作用机制，为卵巢癌转移的发生发展机制提供理论意义，我们首先探讨了Gab2在体内实验中对于卵巢癌转移性生长的影响，其次探讨了卵巢癌细胞株中Gab2如何通过调控miR-200c来影响卵巢癌干细胞样特性细胞的迁移和侵袭能力。
方法：
1.用逆转录病毒载体在卵巢癌细胞株（OVCAR5和OVCAR8）中高表达Gab2。
2.检测Gab2高表对卵巢癌肿瘤干细胞特性的影响：1）利用流式细胞仪技术检测细胞中ALDH+细胞群的数量。2）观察卵巢癌细胞形成肿瘤微球体能力的变化情况。
3.卵巢癌成瘤模型的建立：用稳转有Luciferase-GFP基因的卵巢癌细胞OVCAR5（vector组和Gab2高表组）腹腔注射入nu/nu裸鼠中。用小鼠活体成像仪来观察两组卵巢癌细胞在裸鼠腹腔中转移性生长的能力。
4.检测Gab2高表对卵巢癌细胞中miR-200c表达的影响情况：采用TRIZOL试剂提取细胞总RNA，利用实时荧光定量PCR技术检测miR-200c的表达情况。
5.经PI3K抑制剂GDC-0941处理以后，利用实时荧光定量PCR技术检测vector组和Gab2高表组卵巢癌细胞中miR-200c的表达情况。
6.经miR-200c模拟体（mimic）处理以后，检测vector组和Gab2高表组卵巢癌细胞中的EMT标志物蛋白的表达影响：利用westernblot技术检测卵巢癌细胞中P-AKT，E-cadherin，CD44的表达情况。
7.经miR-200cmimic处理以后，检测vector组和Gab2高表组卵巢癌细胞的功能变化情况：细胞分为三组：vector+miR-con组，Gab2+miR-con组，Gab2+miR-200c组。功能试验包括tranwell细胞迁移和侵袭，肿瘤微球体形成实验。
8.经miR-200cmimic处理以后，检测卵巢癌细胞中的肿瘤干细胞标志物的变化情况：细胞分为三组：vector+miR-con组，Gab2+miR-con组，Gab2+miR-200c组。利用流式细胞仪技术检测卵巢癌细胞中的ALDH+细胞群数量和检测肿瘤微球体形成效率。
9.经siRNA-CD44处理以后，检测vector组和Gab2高表组卵巢癌细胞迁移和侵袭能力的变化情况：细胞分为三组：vector+siRNA-con组，Gab2+siRNA-con组，Gab2+siRNA-CD44组。
结果：
1.Gab2高表促进卵巢癌细胞中ALDH+细胞群的数量上升，并且卵巢癌成球实验形成的微球体个数增加。
2.Gab2高表促进卵巢癌细胞在裸鼠腹腔中转移性生长的能力增强。
3.Gab2高表抑制miR-200c在卵巢癌细胞中的表达。
4.Gab2高表卵巢癌细胞中加入PI3K抑制剂GDC0941后，其miR-200c的表达量升高。
5.Gab2高表的卵巢癌细胞经过miR-200cmimic处理以后，与对照miRNA处理相比，E-cadherin的表达量升高，CD44的表达量降低。
6.Gab2高表的卵巢癌细胞经过miR-200cmimic处理以后，与对照miRNA处理相比，其迁移和侵袭能力下降。
7.Gab2高表的卵巢癌细胞经过miR-200cmimic处理以后，与对照miRNA处理相比，卵巢癌细胞中ALDH+细胞群的数量减少，并且卵巢癌细胞成球个数也减少。
8.Gab2高表的卵巢癌细胞经过siRNA-CD44处理以后，与siRNA-对照相比，其迁移和侵袭能力降低。
结论：
在本研究中，我们利用流式细胞技术和癌细胞微球体形成实验分析检测了Gab2的表达对卵巢癌肿瘤干细胞生长特性的影响。在两种不同的卵巢癌细胞系OVCAR5和OVCAR8中，我们发现Gab2可以增加ALDH+细胞的数量和促进癌细胞微球体的形成。此外，Gab2可以促进OVCAR5细胞在裸鼠中的转移性生长。从机制上，我们发现Gab2可以通过激活PI3K从而特异性地抑制miR-200c的表达。Gab2通过下调miR-200c来促进卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力，EMT特性以及ALDH+细胞的扩增和癌细胞微球体的形成。此外，Gab2通过miR-200c下调促进CD44表达和细胞迁移/侵袭。我们的发现支持了一个模型，即Gab2-PI3K通路通过下调miR-200c来促进CD44表达、EMT特征和卵巢癌干细胞样细胞生长。涉及miR-200c或靶向CD44的疗法可能有助于治疗Gab2过表达的卵巢癌。