手性醇作为一类重要的手性砌块,被广泛的用于手性药物、农用化学品和精细化学品的合成。全细胞生物催化法合成手性醇具有环境友好、条件温和、产物立体选择性高等优点。高效的羰基还原酶和充足的胞内NADPH供应是实现该技术的两个关键因素。本论文首先通过基因挖掘技术获得了一种新型耐碱羰基还原酶（BsCR）,同时利用基因工程技术对重组菌代谢途径进行改造有效地提高了胞内辅酶NADPH的供应,在此基础上进一步研究了重组菌在手性醇合成中的应用。具体研究内容如下:（1）利用基因组狩猎法从Bacillus subtilis（strain 168）中获得了一种新型耐碱羰基还原酶基因yueD（解码酶命名为BsCR）,并成功在重组菌E.coli BL21（DE3）/pET-32a-yueD中过量表达。对BsCR酶学性质研究结果表明该酶催化反应的最适条件为45℃、pH 6.3,同时BsCR在碱性环境下具有良好的结构稳定性;该酶在进行催化反应过程中对金属离子没有依耐性,过渡金属阳离子Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺对酶活的促进作用比较明显。以4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）为底物时,最大反应速率为147.3μmol·min^-1·mg^-1,对底物NADPH和COBE的K_m值分别为5.390×10^-2 mmol/L和1.855 mmol/L。（2）为了提高胞内辅酶NADPH的供应,本文通过以下两种代谢调控策略来强化E.coli胞内NADPH的再生效率:a)引入来源于Bacillus subtilis（strain 168）的NADP⁺依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶（NADP⁺-GAPDH,基因gapB）对重组大肠杆菌的糖酵解途径（EMP）进行改造,实现了辅酶NADPH在EMP途径中的高效再生,NADPH的供应量提高了1.53倍;b)通过过表达NAD激酶（NADK,基因yfjB）来强化NADP⁺的内源性合成途径,NADPH供应量提高了1.74倍。（3）构建了强化辅酶NADPH再生的手性醇高效合成工程菌并研究了代谢调控过程与结果。通过基因串联表达系统和双质粒共表达系统,构建了E.coli BL21（DE3）/pETDuet-1-gapB-yueD&pET-28a-yfjB和E.coli BL21（DE3）/pETDuet-1-yfjB-yueD&pET-28a-gapB。利用荧光定量PCR技术对代谢中相关基因的表达情况进行分析,结果表明E.coli BL21（DE3）/pETDuet-1-gapB-yueD&pET-28a-yfjB体内基因yueD、gapB和yfjB的相对表达量分别提高了88.00、150.00和157.82倍;E.coli BL21（DE3）/pETDuet-1-yfjB-yueD&pET-28a-gapB体内基因yueD、gapB和yfjB的相对表达量分别提高了61.53、172.24和168.40倍。同时,对胞内NADPH的检测结果表明,两种菌的胞内NADPH含量分别提高了2.40和2.34倍。（4）研究了重组菌在全细胞催化不对称还原反应合成手性醇中的应用。将E.coli BL21（DE3）/pETDuet-1-yueD应用于模式底物苯乙酮和COBE的还原反应。还原产物S-苯乙醇和S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（S-CHBE）的对映体过量值（e.e.值）均超过99.0%。其中,S-CHBE的产率在反应进行到4 h时达到89.9%;S-苯乙醇的产率在12 h时达到66.7%。进一步的研究了辅酶NADPH代谢调控对手性醇合成的影响,结果表明E.coli BL21（DE3）/pETDuet-1-gapB-yueD&pET-28a-yfjB作为全细胞催化剂对底物的转化效率最高,S-苯乙醇的产率在反应8 h时达到99.2%,S-CHBE的产率在反应进行到3 h时达到99.1%。对重组菌催化苯乙酮不对称还原反应的反应条件进行优化,结果表明,在40℃下、pH 8.0的PBS缓冲液中,苯乙酮底物浓度为70 mmol/L时,还原反应的效率最佳。本研究不仅通过基因组狩猎法获得了一种性能优秀的羰基还原酶,丰富了手性醇生物合成酶酶库;同时通过对胞内EMP代谢途径和NADP⁺合成途径的调控加强了胞内NADPH供应量,从而促进了全细胞催化不对称还原手性醇的高效合成。本论文的研究工作为辅酶NADPH代谢调控和手性醇的生物合成提供了理论和实践基础,推动了生物合成工业前进的步伐。