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鱼类诺卡氏菌病(Nocardiosis)是一种以鱼体分布白色结节为典型症状的疾病,该病潜伏时间长、死亡率高、防治困难,严重影响鱼类养殖业。本研究从四川邛崃发生结节病的加州鲈(Micropterus salmoides)皮肤溃疡灶、鱼鳔腔积液和肝脏中分离到一株革兰氏阳性菌,经回归实验确定致病性,通过经细菌形态、生理生化特性、16S rDNA基因系统发育树构建等方法,确定该病病原为鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolea),并命名为菌株HSY-NS02。该菌生长缓慢,扫描电镜显示菌体呈分枝杆状,平均大小为10.1±2.3μm×0.7±0.2μm;透射电镜下可见明显两层结构。该菌对庆大霉素、新霉素和制霉菌素3种药物敏感。组织病理学观察显示,皮肤溃疡灶、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和鳃发生不同程度的慢性炎性肉芽肿病变,其中脾脏病变最为严重。为进一步研究该菌的致病性,全基因组测序和分析结果显示:菌株HSY-NS02的全基因组大小为776219 bp。上传至GenBank获得登录号RCNK00000000。利用ARDB数据库注释得出17个耐药基因。利用VFDB数据库注释得出5个潜在的毒力因子。同时,进一步使用BRIG软件进行比较基因组共线性分析,发现一段特异性序列区域,为哺乳动物细胞进入蛋白家族(Mammalian cell entry Mce family proteins,MCE)蛋白家族中的Mce4操纵子。在此基础上,克隆表达了Mce4操纵子中mce4E基因,以表达的mce4E蛋白刺激EPC(Epithelioma papulosum cyprini,鲤鱼上皮瘤细胞系)细胞并腹腔注射入健康加州鲈体内,菌株HSY-NS0做同样操作,以探讨该蛋白的毒性功能。具体研究结果如下:一、mce4E蛋白和菌株HSY-NS02对EPC细胞的影响将mce4E蛋白和菌株HSY-NS02分别与EPC细胞共孵育24 h。经流式细胞术检测,结果显示,mce4E蛋白造成EPC早期凋亡率达到5.15±0.13%,极显著(P<0.01)高于菌株HSY-NS02和对照组的早期凋亡率。二、mce4E蛋白和菌株HSY-NS02对加州鲈的影响将mce4E蛋白和菌株HSY-NS02分别与弗氏不完全佐剂等比例乳化,腹腔注射加州鲈,观察和记录死亡数量,同时进行组织病理学观察。检测加州鲈的非特异性免疫指标(血清总蛋白含量、血清超氧化物歧化酶SOD活性、血清溶菌酶含量)以期了解mce4E蛋白对加州鲈非特异性免疫的影响。结果显示mce4E蛋白能造成加州鲈死亡,死亡率为35%。非特异性免疫指标检测显示,菌株HSY-NS02能造成加州鲈血清SOD活性下降并维持在较低的水平,血清总蛋白和溶菌酶含量上升并维持在较高的水平;mce4E蛋白能造成加州鲈血清SOD活性呈现先降低后升高最终与对照组差异不显著(P>0.05)的规律。血清总蛋白和溶菌酶含量先升高后降低,最终与对照组差异不显著(P>0.05)的规律。组织病理学观察结果显示,加州鲈感染菌株HSY-NS0221 d后,肝脏组织边缘可见中期肉芽肿病变,肉芽肿中心坏死程度不高,尚可见部分细胞形态。肝脏组织中心则多见早期肉芽肿病变,无成熟的中心坏死灶,其他器官组织则并未出现明显病理变化;加州鲈感染mce4E蛋白21 d后组肝脏组织出现气球样病变,未见明显的肉芽肿病变,其他器官组织则并未出现明显病理变化。