研究背景和目的：胃癌是威胁人类健康最常见的恶性肿瘤之一,胃癌占目前世界恶性肿瘤第四位,肿瘤相关性死亡排名第二位。在中国,胃癌的发病率仍居各大恶性肿瘤发病率的前列,且呈上升趋势。在陈万清教授2015年发表的文章中对中国癌症发病率和死亡率统计,胃癌占男性患者恶性肿瘤发病率第二位,女性患者恶性肿瘤发病率第三位。男性患者和女性患者胃癌死亡率均位于恶性肿瘤导致死亡第二位。胃癌的发病过程是一个聚集了遗传、外界环境及生活习惯等诸多因素于一体的复杂的病理过程,且其确切的病理机制仍然不是十分清楚。其中,幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)感染是比较重要的危险因素之一,其在世界范围内感染广泛,与胃炎、消化性溃疡乃至胃癌发生密切相关,1994年被WHO正式列为Ⅰ类致癌因子。目前,多数研究显示在由慢性胃炎、胃粘膜溃疡、萎缩、肠化生、异型增生直至胃癌的演变过程中,H. pylori可能起先导作用,成为胃癌发生的一个始动因素。因此,深入的探讨幽门螺杆菌在胃癌的发生和发展过程中的作用机制,并将其应用于胃癌疾病的早期预防、早期诊断和治疗对胃癌的防治具有重要的意义。H. pylori感染是慢性胃炎、消化性溃疡的主要致病因子之一,且与胃癌的发病密切相关。H. pylori感染引起的免疫反应十分复杂,虽然机体对于H. pylori感染能够引发强烈的细胞和体液免疫,但是并不能有效地清除细菌,而是导致感染状态常常持续存在,甚至伴随一生。H. pylori感染后引起炎症反应虽然是H. pylori致病的重要因素之一,但很多H. pylori感染者却并没有明显的临床症状。因此,H. pylori在与人类长期共存的过程中,相互之间构成了一个复杂的网络,得以精细调控H. pylori感染的免疫反应。目前已发现的免疫调控因素包括：调节性T细胞、抑制型细胞因子、交叉抗原的免疫逃避等,但是关于H. pylori感染的确切免疫调控机制仍不十分清楚。胃黏膜上皮细胞作为细菌感染的第一道屏障,通过表达Toll样受体(TLR)启动胃黏膜固有免疫。研究发现在人类胃黏膜细胞中,Let-7b靶向结合TLR4mRNA直接调节TLR4的表达,继之影响核转录因子-KB活性及下游基因的表达。导致细胞因子及趋化因子的产生,从而导致单核细胞、巨噬细胞和白细胞的聚集,在胃黏膜固有免疫和炎症过程中起着重要作用。有研究表明miR-30b可减弱细胞的自我吞噬作用,导致H. pylori逃过细胞的自我吞噬,从而导致H.pylori的慢性持续感染。许多研究均提示miRNA在H. pylori诱导的炎性反应发生和发展中起关键性作用。H. pylori感染是胃癌发生重要因素,但具体机制尚不清楚,随着miRNA的发现及其作用的逐渐阐明,越来越多的证据表明miRNA与胃癌的发生和发展密切相关。 H. pylori感染引起miRNA的表达水平变化,可以通过影响胃黏膜炎性反应、癌基因或抑癌基因的表达、基因甲基化,进而参与到胃癌的发生和发展过程中。H. pylori却感染后导致miRNA异常表达可能与肿瘤的转移有关。MiR (miRNA)是长度在19-25个核苷酸左右的内源性非编码小分子RNA。这些小分子通过RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)靶向到达nRNA,进而行使阻遏翻译或引导酶切的功能。最近有研究显不,niRNA有多种生物学功能,他们的初级转录产物经过一系列核酸酶的剪切加工后形成成熟miRNA分子,进而参与到调节细胞和早期胚胎的发育、细胞分化、细胞增殖与凋亡、细胞代谢等重要的生理过程中。目前发现miRNA广泛地存在于植物、线虫和哺乳动物等生物中。迄今为止,共发现约8000多个miRNA。有研究报道,miRNA具有肿瘤抑制因子及癌基因的作用。在癌症发生和发展中发挥作用的miRNA被称为oncogenic miRNA,即oncomiR。 OncomiR的失调与基因突变或表观遗传变异有关,这些变异包括缺失突变、扩增突变、点突变及DNA异常甲基化等. miRNA的表达情况与人类多种恶性肿瘤的发生、发展、诊断、治疗和预后密切相关。对胃癌miRNAs表达的研究显示了它们在这一领域的重要性和潜在的用途。一些miRNAs,例如niR-9、miR-21、miR-27a、 miR-143、miR-145、miR-433和miR-451等已经被证实在胃癌中发挥重要的调控作用。近年来,对miRNAs与免疫系统关系的研究是热点,miRNAs被证实参与了淋巴细胞的发育和分化、抗体的产生及固有免疫应答调控过程。此外,miRNAs与肿瘤发生、发展的关系也日益成为现代科研的热点。研究发现miRNAs广泛参与细胞的发育、分化、细胞增殖凋亡、代谢等各种生命活动,以及各种生物学进程的调控。大约50%的miRNAs定位于基因组的肿瘤基因相关区域或脆性位点,作为新的一类癌基因或抑癌基因。研究发现,miRNAs的表达失衡与多种恶性肿瘤的发生密切相关,例如,肺癌、肝癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、淋巴瘤等。目前,也发现多种miRNA可能与胃癌的发生发展相关,已证实miR-21、miR-106b-25、miR-221、miR-218等参与了胃癌的发生与发展,其表达的高低与预后也息息相关。目前,Zhang等发现miR-21在H. pylori感染的胃癌细胞株中表达增高,且miR-21在胃癌发生过程中可能发挥癌基因的功能,从而提示由H. pylori介导的胃癌的发生也存在miRNAs的参与和调控。本部分研究基于既往研究及文献复习,我们分析了H. pylori感染对胃上皮细胞miRNAs表达谱的影响；筛选出了一系列差异表达的miRNAs,并以miRNA221和miRNA222为深入研究对象,初步探讨H. pylori感染诱导miRNA221和miRNA222高表达的分子机制,以及miRNA221和miRNA222调控肿瘤的作用,为阐明H. pylori的免疫调控机制提供新线索和方向。是否有其他更多的miRNA参与到幽门螺杆菌感染后的胃癌病理发生发展过程,也是我们值得进一步深入研究的方向。胃癌作为常见恶性肿瘤之一,miRNA221/222是否与胃癌相关,两者是否参与胃癌癌变过程及其机制的相关研究尚未有开展。本研究目的在于探讨miRNA221/222在胃癌组织及胃癌细胞中的表达改变及其对胃癌发生发展的影响,以期为胃癌的发病机制研究提供新的线索,为在胃癌的诊断、治疗及其早期防治领域的实践和应用提供更多的实验依据。反转录富含半胱氨酸蛋白(reversion-inducing cysteine-rich protein with kazal motifs, RECK)基因是于1998年发现的一种新抑癌基因。RECK基因是基质金属蛋白酶(matrix metal loproteinase, MMPs)抑制剂。研究表明,其可在转录后水平抑制多种MMP的表达,抑制肿瘤血管的生成,从而抑制肿瘤的侵袭于转移,是许多癌基因共同的负向调控基因。miR-21, miR-25, miR-222和miR-374也可以抑制RECK蛋白的表达促进胃癌的发展。RECK蛋白作为胃癌的重要肿瘤抑制蛋白,其上调因子的研究显得很有必要性。本研究旨在探索幽门螺杆菌感染后导致miR-221和miR-222的失调情况以及其两者是如何作用于胃癌的病理发展进程。方法：1、miR-221和miR-222在H. pylori感染慢性胃炎和H. pylori阴性对照组中的表达分析。在给予充分告知及知情同意后,20例胃黏膜组织学标本的取材均通过胃镜取材获得,采集自四川省成都市第一人民医院内镜室。其中10例幽门螺杆菌阳性的慢性胃炎患者(平均年龄42岁,其中男性6人,女性4人),10例幽门螺杆菌阴性的对照组(平均年龄38岁,其中男性和女性各5人)。并经快速尿素酶检测、H pylori培养及病理组织学表现判定H pylori感染情况。胃癌组织和胃癌邻近正常组织的取材是通过对8例行远端胃癌根治术后的患者取材获得的。采集自四川省成都市第一人民医院手术室；其中UIAC国际肿瘤TNM分期为6例Ⅰb期和2例Ⅱ期。通过实时荧光定量PCR (realtime PCR)技术,分别检测miRNA221和miRNA222在H. pylori感染慢性胃炎和H. pylori阴性正常对照组胃粘膜组织中的表达水平差异。2、miR-221和miR-222在H. pylori阳性的胃癌组织和邻近正常组织中的表达差异分析。组织学标本通过胃癌手术后患者的标本取材,通过realtime PCR技术,分别检测miRNA221和miRNA222在H. pylori感染胃癌组织和邻近正常胃粘膜组织中的表达水平。应用特异性stem. 100p引物完成逆转录,并同时采用灵敏的Taqman real time PCR技术检测以上标本中miRNA221和miRNA222的表达水平。计算不同组织间niRNA221和miRNA222表达水平差异。数据结果采用SPSS17.0进行统计分析,采用二样本t检验判定2组间的显著性差异,以p<0.05作为显著性判定标准。3、体内外分析miR-221和miR-222对胃癌细胞增殖、凋亡和侵袭力的检测。应用gain- and loss-of function实验方法来分别验证miRNA221和miRNA222表达水平变化对细胞功能的影响。胃癌细胞株AGS和SGC-7901首先将miRNA221和miRNA222前体序列转染至细胞内,使细胞miRNA221和miRNA222表达水平升高；相反,通过转染人工合成的特异性miRNA221和miRNA222抑制剂来降低细胞内miRNA221和miRNA222表达水平。通过CCK-8检测miRNA221和miRNA222对胃癌细胞株增殖的影响；使用流式细胞仪检测转染不同miRNA片段后细胞增殖情况与细胞周期分布的变化,采用软琼脂集落形成试验检测转染miRNA221和miRNA222后肿瘤细胞非锚着依赖性生长能力的改变,以检测两者对细胞的侵袭力的影响。数据结果采用SPSS17.0进行统计分析,采用二样本t检验判定2组间的显著性差异,以p<0.05作为显著性判定标准。4、预测、鉴定miR-221和miR-222的靶基因,检测靶基因与miR-221和miR-222在不同胃癌细胞株和胃癌组织样本中的表达水平及相关性。首先用miRNAs靶基因预测数据库TargetScan 6.2软件预测miR-221和miR-222的靶基因,RECK可能是miRNA-221和miRNA-222的一个靶位。Lueiferase reporter assay结果进一步证明RECK是miRNA-221和miRNA-222重要的靶基因。并且在幽门螺杆菌感染后的AGS细胞内表达增加,RECK蛋白表达降低。进一步构建靶基因报告载体,利用双荧光素酶报告系统、GFP荧光抑制分析、Western blot技术鉴定之；利用real time PCR和Western blot,检测靶基因与miRNA-221和miRNA-222在不同胃癌细胞株和胃癌组织样本中的表达水平及相关性。通过预实验我们选择两个对幽门螺杆菌干预因素比较明显的细胞株SGC-7901细胞和AGS细胞来进行后续的miRNA转染实验。SGC-7901细胞和AGS细胞分别转染50nM的miR-221或miR-222片段,100 nM的antagomiR-221或antagomiR-222片段,共转染40 nM的miR-221和40nM的miR-222片段,共同转染75 nM的antagomiR-221和75 nM的antagomiR-222,或共同转染阴性对照片段(RiboBio, China),再通过阳离子脂质体RNAiMAX的作用(Invitrogen, USA)分别检测相应细胞组中的相应miRNA。通过实时荧光定量PCR法分别检测幽门螺杆菌阳性的慢性胃炎组和幽门螺杆菌阴性的正常对照组间miRNA-221和miRNA-222的表达差异以及检测幽门螺杆菌阳性胃癌组织及周围邻近非肿瘤正常组织种miRNA-221和miRNA-222的表达差异。通过培养不同的非胃癌细胞株和胃癌肿瘤细胞株,经过幽门螺杆菌的转染,分别检测转染前后miRNA-221和miRNA-222的表达差异,来进一步验证。双荧光素酶法来验证miRNA-221 /miRNA-222和RECK 之间的假定结合位点。通过敲除和获得的方式来评估验证miR-221/222-RECK通路在胃癌的作用。结果：1、miR-221和miR-222在H. pylori感染慢性胃炎和H. pylori H. pylori阴性对照组中的表达分析。本实验首先通过检测幽门螺杆菌阴性的正常对照组和幽门螺杆菌阳性慢性胃炎组中miR-221和miR-222的表达差异。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测结果显示幽门螺杆菌阳性的慢性胃炎组中miR-221和miR-222的表达比幽门螺杆菌阴性的正常对照组中显著增高。2、miR-221和miR-222在H. pylori阳性的胃癌组织和邻近组正常织中的表达分析。检测miR-221和miR-222在幽门螺杆菌阳性的胃癌组织和幽门螺杆菌阳性胃癌患者胃癌邻近正常组织种的表达差异,结果提示miR-221和miR-222在幽门螺杆菌阳性8名胃癌患者的胃癌组织中的表达比邻近组织中的表达明显增加。定量检测转染幽门螺杆菌前和转染后miR-221和miR-222在GES-1, BGC-823, SGC-7901和AGS中的表达差异。结果显示幽门螺杆菌转染后上述细胞系中miR-221和miR-222的表达式显著增加的。3、分析miR-221和miR-222对胃癌细胞增殖、凋亡、侵袭力的影响。通过分别将细胞转染过表达的miR-221和miR-222微小片段,使用相应的miR-221和miR-222拮抗剂进行敲除,通过CCK-8细胞计数发现敲除miR-221和miR-222后AGS和SGC-7901细胞增殖被显著抑制。相反,miR-221和miR-222过表达的AGS和SGC-7901细胞增殖被显著提高。在细胞的培育过程中,AGS和SGC-7901细胞分别敲除内源性miR-221和miR-222后,其细胞凋亡显著上升,说明miR-221和miR-222能显著抑制AGS和SGC-7901细胞的凋亡。此外,在孵化24小时候,去除上层细胞,对基层细胞进行固定,荧光染色20分钟后,在放大100倍光学显微镜下观察相应AGS细胞和SGC-7901细胞系的侵袭力的变化发现,miR-221和miR-222的过表达可以显著增强AGS和SGC-7901胃癌细胞的侵袭力。以上结果提示miR-221和miR-222都能调节胃癌细胞的增殖,凋亡和侵袭力。4、预测、鉴定miR-221和miR-222的靶基因,检测靶基因与miR-221和miR-222在不同胃癌细胞株和胃癌组织样本中的表达水平及相关性。在HEK-293T细胞株和SGC-7901细胞株的实验中,miR-221和miR-222都能显著抑制转染pGL3-RECK-wt质粒后的荧光活性,但转染的pGL3-RECK-mut质粒后的荧光活性无影响。AGS和SGC-7901细胞系中,转染miR-221和miR-222片段后都可以显著减少RECK蛋白的表达。同时,共同转染miR-221和miR-222后在RECK蛋白的表达中起到叠加作用。相反,抑制内源性的miR-221和miR-222后,AGS和SGC-7901细胞系中RECK蛋白的表达会显著增加。而且,同时敲除内源性的miR-221和miR-222后,RECK蛋白的表达会比单独敲除miR-221或miR-222增加更明显。以上实验结果揭示miR-221和miR-222都可以直接作用于RECK基因的靶点,并调节RECK蛋白的表达。因此,我们通过实验设计进一步检测胃癌细胞的增殖浸润和凋亡过程中miR-221和miR-222与RECK基因之间的作用关系。为了过表达RECK, AGS、SGC-7901细胞首先转染了PCDNA3.1-RECK质粒。miR-221和miR-222都不能抑制这个质粒蛋白的表达。RECK基因的过表达显著逆转了miR-221或miR-222诱导的较快的细胞生长。RECK过表达也显著抑制了miR-221或miR-222诱导的高的细胞侵袭力。以上结果均提示幽门螺杆菌感染能导致miR-221和miR-222的表达增加。幽门螺杆菌感染导致miR-221和miR-222在胃癌细胞及组织中的表达显著增加。miR-221和miR-222均可以结合于相同的RECK基因3’UTR序列端,从而调节其表达。证实了假设的miR-221和miR-222通过作用于RECK基因可以促进胃癌细胞的增值和侵袭。结论：通过本实验研究发现,幽门螺杆菌感染可以导致胃黏膜组织和胃上皮细胞中miR-221和miR-222的表达显著增加,幽门螺杆菌感染阳性的胃癌组织中miR-221和miR-222的表达比幽门螺感染阳性的胃癌邻近非肿瘤正常组织中显著增加。miR-221和miR-222都可以通过有效结合于RECK基因的3’-UTR发生影响,通过在转录后水平调节RECK蛋白的表达来发挥作用。通过选取AGS和SGC-7901两个胃癌细胞株来进行细胞学实验发现,miR-221和miR-222都能够促进胃癌细胞的增殖,增加胃癌细胞的侵袭力,负向调节胃癌细胞的凋亡。通过转染获得miR-221或/和miR-222片段和敲除相应miRNA的方式,本实验研究发现其调节途径是通过miR-221/222-RECK途径来完成的。幽门螺杆菌感染目前被WHO定义为胃癌的Ⅰ类致癌因素。而幽门螺杆菌感染致癌的具体机制目前仍没有完全研究清楚。通过本实验研究的结果提示miR-221/222-RECK途径可能是幽门螺杆菌感染导致胃癌的重要调节通路。