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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)、猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)、猪轮状病毒病(Porcine rotavirus disease,RVD)是猪场常见的病毒性腹泻,分别由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)及猪轮状病毒(Porcine rotavirus,RV)引起的,给养猪业造成了巨大的经济损失。三种病毒引起的腹泻具有类似的传染途径和临床症状,感染猪临床均表现为水样腹泻、呕吐、脱水及新生仔猪的高死亡率,三者流行病学和病理剖检也极其相似,但三种病原没有共同的抗原性,不能交互免疫,而又有混合感染,也易继发其他细菌性感染,导致仔猪死亡率升高或生长缓慢。目前,常规的诊断方法如病毒分离、血清学诊断方法等存在着耗时长、敏感度低的缺陷,已不能满足现实临床诊断需要。多重PCR方法具有敏感性高且可以一次检测多种病原的优势,更适于混合感染的快速诊断。在临床检测时发现进行了免疫的猪群会出现PED现象,为了检测山东省猪场PEDV免疫水平,对免疫猪进行抗体检测,免疫后的抗体的跟踪检测,建立了针对S基因主要抗原表位的原核表达,并利用S90蛋白建立了间接ELISA方法。本研究共分为3部分:1.PEDV-TGEV-RV多重PCR方法建立本文进行了PEDV、TGEV和RV多重RT-PCR检测方法的研究。根据近几年来山东主要流行株PEDV、TGEV和RV的保守基因M、N和VP7分别设计了特异性引物,分别扩增出预期的311bp、763bp和516bp的目的片段,成功建立同时检测猪三种常见病毒感染的多重PCR方法。通过敏感性和特异性的试验,发现本方法对PEDV的最高敏感度为30pg,TGEV的最高敏感度为18pg,RV的最高敏感度为42pg,并通过对其他常见几种病原进行PCR扩增,发现本方法特异性良好,可以应用于临床样品检测。利用该检测方法对2015年到2016年来自山东省济南、泰安、莱芜等发病猪场的412份临床病料进行检测,结果表明PEDV、TGEV和RV的阳性率分别为22.3%、7.28%和1.46%,PEDV与TGEV、PEDV与RV、TGEV与RV双重混合感染阳性率分别为5.34%、1.94%和2.91%,PEDV、TEGV和RV三重感染阳性率为4.85%。同时用文献报道的单一RT-PCR法对以上样品进行检测,结果符合率为100%。结果表明,建立的三重RT-PCR具有较敏感度和特异性,可用于临床PEDV、TGEV和RV的检测。2.PEDV S90基因的原核表达与条件优化本试验设计一对引物,以PEDV山东流行毒株为扩增模板,扩增了PEDV的S基因的主要抗原表位区,并连接到原核表达载体pET-32a(+),构建了重组表达质粒,导入表达菌E.coli BL21(DE3),通过对表达时间,诱导剂的使用量等条件的摸索,使构建的pET32a-S90质粒在宿主菌中大量稳定的进行蛋白表达,通过对优化条件的摸索得出:最佳的表达条件诱导剂IPTG终浓度为1mmol/mL的,37℃,220rpm,诱导表达6h时蛋白表达量最大。经过对菌体蛋白纯化获得纯度较高的目的蛋白,Western blot检测表明,表达的重组S90蛋白能与PEDV阳性血清发生特异性反应,不与其他常见猪病阳性血清发生反应,说明该蛋白具有一定的反应原性。3.PEDV间接ELISA方法的建立和初步应用利用纯化的原核表达S90蛋白为包被抗原,建立了检测猪体内PEDV抗体的间接ELISA方法。优化条件为S90蛋白最佳包被量为2μg/mL,4℃孵育过夜,最佳包被液为5%脱脂奶粉,被检血清最佳稀释度为1:100,抗体最佳反应时间为37℃2h,二抗按1:4000稀释,37℃1.5h,显色液的最佳终止时间为室温15min,阳性的Cut-off值为0.204。以建立的间接ELISA方法对采山东省莱芜2个未免疫猪场120头猪进行抗体检测,总体检测抗体为54.15%,其中母猪感染抗体阳性率为60%,育成猪抗体阳性率为48.3%,抗体阳性率不高,存在严重的野毒现象。对山东省济南三个免疫猪场195头猪进行抗体检测和免疫后抗体跟踪,检测结果显示,检测的血清中PEDV抗体的总阳性率为70.3%,其中母猪血清PEDV抗体阳性率为64.8%,育成猪血清PEDV抗体阳性率为76.7%。跟踪检测猪场免疫后抗体水平消长规律,7d抗体开始上升,28d达到最高。