长期使用糖皮质激素(GCs)可导致严重的副作用,例如骨量减少、骨密度降低而最终引起的糖皮质激素性骨质疏松症(GIOP)。GIOP是最常见的一类继发性骨质疏松症。大约30%-50%接受GCs治疗至少1年的患者患有GIOP,并且其发生骨质疏松性骨折的风险高,即使轻微的损伤后也会发生脊柱、髋骨和肋骨的骨折。GIOP是严重影响长期使用GCs患者生活质量的不良因素。因此,GIOP的防治具有重要的临床意义。针对GIOP病因进行干预治疗才能取得最好的疗效。GIOP的发病机制与年龄、雌激素缺乏、制动等因素引起的骨质疏松症(OP)不同。GCs直接作用骨髓间充质基质细胞(BMSCs),诱导其分化成脂肪细胞并导致骨髓腔内脂肪细胞堆积,引起骨髓脂质代谢紊乱,严重影响成骨细胞分化,骨形成减少,最终导致骨质疏松。因此,GCs引起的骨髓脂质代谢紊乱在GIOP发病机制中起着重要作用。长期使用GCs也可以促使骨髓外脂肪组织动员和分解,增高机体血清总胆固醇(TCHO)和甘油三酯(TG)水平,导致高脂血症,而高血脂症可先于骨质疏松出现。脂质代谢和骨质疏松有着密切关系。临床上应用降血脂药物治疗的同时可增加患者骨密度水平,降低骨折的风险。如果能有效的抑制骨髓脂质代谢紊乱和纠正机体血脂异常状态,可以对GIOP的发病、骨质疏松程度、骨折风险起到防治作用。GIOP临床药物治疗花费高、副作用多,因此有必要探寻一种安全、副作用小、费用低廉的治疗方法。脉冲电磁场(PEMF)作为一种无创的物理因子治疗手段,已经广泛应用于多种骨科疾病。循证医学已证实PEMF在治疗骨质疏松方面安全且有效,可以作为防治OP的辅助手段。临床与实验研究发现PEMF在抗骨质疏松的同时还可以改善机体的血脂异常。目前尚未有研究PEMF通过调节GIOP脂质代谢途径干预骨代谢的相关报道。介于脂质代谢对GIOP发病的影响,探讨PEMF对GIOP的疗效是否得益于对其脂质代谢的调控,对PEMF防治GIOP的机制研究有着重要意义。目前采用GCs诱导GIOP动物模型的方法很多,但GCs选择、给药途径、用药剂量等要素不统一,会对后续研究工作造成一定影响。本研究在参考相关文献的基础上,拟采用肌注地塞米松的方法建立GIOP大鼠模型,为规范建立GIOP动物模型提供相关实验依据,同时探讨PEMF调控GIOP大鼠脂质代谢信号通路的机制及其对骨代谢的影响,对于初步阐明PEMF抗骨质疏松的机制具有重要的科学意义和相关临床应用价值。第一部分GIOP大鼠模型的建立目的采用肌注超生理剂量的地塞米松构建GIOP大鼠模型,试图建立可靠稳定的造模方法,为探讨PEMF治疗GIOP的潜在机制提供实验对象。方法20只健康雌性SD大鼠随机分为对照组和GIOP模型组。GIOP模型组大鼠右侧臀部肌注地塞米松(2.5 mg/kg,每周2次)连续12周。对照组大鼠右侧臀部肌注生理盐水(0.5 ml/kg,每周2次)连续12周。12周后进行骨密度、骨组织形态计量学分析、骨代谢生化指标和脂质代谢生化指标检测评价GIOP大鼠模型。结果与对照组大鼠相比,模型组大鼠全身骨密度和骨矿盐含量明显下降,骨小梁破坏严重、数量减少,血清ALP水平降低,血清TRAP、TG,TCHO和LDL水平均显著升高。结论肌肉注射地塞米松(2.5mg/kg,2次/周)12周可以成功建立GIOP大鼠模型,为本研究提供稳定、可靠的动物模型。第二部分PEMF对GIOP大鼠骨髓脂质代谢的影响及机制目的研究PEMF干预对GIOP大鼠BMSCs成脂分化和脂质代谢的影响,探讨相关信号通路的调控,初步阐明PEMF干预GIOP大鼠脂质代谢的作用机制。方法(1)40只健康SD雌性大鼠随机分为正常组、GIOP模型组、钙剂治疗组和PEMF治疗组。GIOP模型组、钙剂治疗组和PEMF治疗组采用肌肉注射地塞米松(2.5mg/kg,2次/周)12周复制GIOP大鼠模型。12周后进行骨密度、骨代谢生化指标和脂质代谢生化指标检测评价GIOP大鼠模型。(2)PEMF治疗组大鼠给予PEMF(50 Hz,4.0 m T)干预12周。钙剂治疗组大鼠给予葡萄糖酸钙片灌胃治疗及PEMF假辐射12周。正常组和GIOP模型组大鼠均给予PEMF假辐射和生理盐水灌胃处理12周。(3)采用血清脂质代谢生化指标检测评价各组大鼠血脂状况;(4)采用油红O染色和L4椎体骨组织病理学观察评价各组大鼠骨髓腔内脂肪细胞分化程度;(5)Real-time PCR检测脂质代谢相关指标PPAR-γ、C/EBPα、FABP4和Axin2基因表达水平;(6)Western bolt检测检测脂质代谢相关指标PPAR-γ、C/EBPα、FABP4和Axin2蛋白表达水平。结果(1)与正常组大鼠相比,GIOP模型组、钙剂治疗组和PEMF治疗组大鼠给予肌注地塞米松12周后全身骨密度和骨矿盐含量明显下降,血清ALP水平降低,血清TRAP、TG,TCHO和LDL水平均显著升高。GIOP大鼠模型复制成功。(2)血清脂质代谢生化指标检测结果表明PEMF干预12周后可以显著改善GIOP大鼠血脂异常;(3)油红O染色和L4椎体骨组织病理学观察表明PEMF干预12周后GIOP大鼠骨髓内脂肪细胞减少;(4)Real-time PCR检测结果表明:PEMF干预12周后GIOP大鼠PPAR-γ、C/EBPα、FABP4和Axin2基因表达水平显著下调;(5)Western bolt检测结果表明:PEMF干预12周后GIOP大鼠PPAR-γ、C/EBPα、FABP4和Axin2蛋白表达水平显著下调。结论PEMF干预能够抑制GIOP大鼠BMSCs成脂分化,减少骨髓内脂肪细胞,改善骨髓脂质代谢紊乱。PEMF干预可能通过下调Axin2/PPARγ信号通路来抑制GIOP大鼠BMSCs脂肪分化。第三部分PEMF对GIOP大鼠骨代谢的影响及机制目的本部分研究以第二部分研究的GIOP大鼠作为实验对象,观察PEMF干预对GIOP大鼠BMSCs成骨分化和骨代谢的影响,进一步探讨相关信号通路的调控,初步阐明PEMF干预GIOP大鼠骨代谢的作用机制。方法(1)采用骨密度及骨矿盐含量检测评价各组大鼠骨量状况;(2)采用血清骨代谢生化指标检测评价各组大鼠骨代谢状况;(3)采用骨组织病理学和骨组织形态计量学分析评价腰椎体内骨小梁状况;(4)采用Real-time PCR检测Wnt10b、LRP5、β-catenin、OPG、RANKL、Runx2、Dkk1和SOST基因表达水平;(5)采用Western bolt检测Wnt10b、LRP5、β-catenin、OPG、RANKL、Runx2、Dkk1和SOST蛋白表达水平。结果(1)骨密度检测结果表明PEMF干预12周可以显著改善GIOP大鼠骨质疏松程度;(2)血清骨代谢生化指标检测结果表明PEMF干预12周后可以显著改善GIOP大鼠骨代谢异常;(3)骨组织病理学和骨组织形态计量学分析结果表明PEMF干预12周后可以改善GIOP大鼠腰椎体内骨小梁状况;(4)Real-time PCR检测结果表明PEMF干预12周后可以显著上调GIOP大鼠Wnt10b、LRP5、β-catenin和OPG基因表达水平,显著下调RANKL和Dkk1基因表达水平;(5)Western bolt检测结果表明PEMF干预12周后可以显著上调GIOP大鼠Wnt10b、LRP5和Runx2蛋白表达水平,显著下调RANKL和Dkk1蛋白表达水平。结论PEMF干预能够促进GIOP大鼠BMSCs成骨分化,改善骨代谢异常,抑制骨量流失,促进骨形成。本部分研究表明PEMF干预激活Wnt10b/LRP5/β-catenin信号通路可能是由于Axin2/PPARγ信号通路被抑制以及Dkk1表达下调来实现。PPARγ-Axin2-Wnt信号轴参与了PEMF对GIOP大鼠骨髓脂质代谢的调节,进而影响其骨代谢,其可能机制是PEMF干预抑制Axin2/PPARγ信号通路从而激活Wnt 10b/LRP5/β-catenin信号通路。