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葡萄胎是一种常见的妊娠滋养层细胞疾病,以滋养层细胞异常增生、绒毛间质水肿及缺乏间质血管为主要特征。据组织病理学和基因起源,葡萄胎可分为部分型葡萄胎和完全型葡萄胎。葡萄胎中滋养细胞过度侵入与肿瘤增生在生物学行为上一致[1],表观遗传学研究表明,肿瘤在发生、发展过程中存在DNA甲基化状态和方式的改变。鉴于葡萄胎与肿瘤发生“无控性”的相似点,从DNA甲基化的角度来探讨葡萄胎的发生可为其机制的进一步阐明开辟新路径。一、方法1、采用Real Time RT-PCR,Western blot和免疫组织化学方法分别检测了甲基化酶Dnmts(DNA methyltransferases)在完全型葡萄胎(Complete Hydatidiform Mole CHM)和正常早期妊娠绒毛中的表达;2、用甲基化DNA免疫沉淀(Methylated DNA Immunoprecipitation,MeDIP)-甲基化芯片分析完全型葡萄胎和正常早期妊娠绒毛中相关基因的甲基化情况;3、用生物信息学分析筛选了差异甲基化基因并进行功能分类;4、用甲基化特异性PCR (methylation specially PCR MSP)检测部分差异甲基化基因。二、实验结果1、Real Time RT-PCR分析结果完全型葡萄胎中Dnmt1(p=0.032),Dnmt3b(p=0.009)的mRNA的表达水平升高,Dnmt3a(p=0.018) mRNA的表达下降,且差异显著(p<0.05)。2、Western blot分析结果完全型葡萄胎中Dnmt1(p=0.047),Dnmt3b(p=0.006)蛋白表达水平升高,Dnmt3a (p=0.009)蛋白的表达下降,与对照组正常早期妊娠绒毛组织相比,差异显著(p<0.05)。3、免疫组织化学分析结果完全型葡萄胎中Dnmt1(p=0.042),Dnmt3b (p=0.016)蛋白表达水平升高,Dnmt3a(p=0.027)蛋白的表达下降,与对照组正常早期妊娠绒毛组织相比差异显著(p<0.05)。Dnmt1,Dnmt3a, Dnmt3b在完全型葡萄胎中主要表达在滋养层细胞的胞浆,Dnmt1, Dnmt3b在正常早期妊娠绒毛组织中表达于部分滋养层细胞的胞浆,Dnmt3a在正常早期妊娠绒毛组织中主要表达在滋养层细胞的胞浆和胞核。4、甲基化DNA免疫沉淀-甲基化芯片分析结果与正常早期妊娠绒毛组织相比较,完全型葡萄胎组织中有122个基因发生了甲基化,其中112个基因可被映射到基因组图谱中,在能够进行功能分类的基因中,TRPC4, KCNT2, KCNQ1, KCNE1L, GABRE, KCNJ8, CLCNKA, KCNH7与离子通道相关;KCNT2, KCNH7, KCNQ1, KCNJ8与钾转运密切相关;UROD, GAD1与羧基酶相关;CLCNKA,KCNH7,KCNJ8 KCNQ1与电压门控通道相关。5、甲基化特异性PCR检测结果甲基化特异性PCR检测部分差异甲基化基因显示,ELN在正常早期妊娠绒毛组织主要表现为非甲基化,在完全型葡萄胎中表现为混合甲基化。E-cadherin,RASSF5,FGF12,SHROOM2,TIMP3在完全型葡萄胎和正常早期妊娠绒毛组织中均表现为混合甲基化。6、分析E-cadherin,RASSF5,FGF12,SHROOM2和TIMP3在完全型葡萄胎和正常早期妊娠绒毛组织中的甲基化程度(M/U),结果显示E-cadherin (p=0.043)在完全型葡萄胎中的甲基化程度高于正常绒毛组织(p<0.05)。三、结论1、与正常早期妊娠绒毛组织相比,完全型葡萄胎中Dnmt1,Dnmt3b的表达升高,Dnmt3a表达下降,且Dnmt3a在胞浆表达,胞核甚少,提示完全型葡萄胎的发生可能是由Dnmt1和Dnmt3b过表达,Dnmt3a低表达及Dnmt3a在胞核的丢失表达引起。2、与正常早期妊娠绒毛组织中相比,完全型葡萄胎中有122个基因发生了甲基化,且MSP验证显示ELN和E-cadherin在完全型葡萄胎中的甲基化程度高于正常早期妊娠绒毛组织,提示完全型葡萄胎的发生与多数基因发生甲基化作用相关,ELN,E-cadherin的超甲基化可能成为完全型葡萄胎潜在的治疗靶点。