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磷(Phosphorus,P)是植物生长所需大量必需元素之一。P在植物生长发育过程中具有多种生物学功能,包括能量产生、核酸合成(DNA、RNA)、糖酵解作用、呼吸作用、光合作用、细胞膜形成、信号转导、磷酸化和去磷酸化反应、氧化还原反应、碳水化合物代谢及氮固定等。植物所利用的磷主要来源于土壤,其主要吸收形式是无机磷酸盐(phosphate,Pi)。土壤中的磷酸盐多数以植物不能吸收利用的形式存在,磷营养缺乏是作物生长发育的限制因素,也是农业面对的主要问题之一。因此,植物磷缺乏应答及调控机制具有重要的理论研究意义,也具有潜在的农业应用价值。拟南芥中MYB-CC家族成员,PHR1(PHOSPHATE STARVATION RESPONSE 1)是低磷应答核心转录调控因子。在低磷应答中,PHR1通过与靶基因启动子中顺式调控元件P1BS(GNATATNC)的结合来激活下游靶基因。此外,WRKY家族转录因子WRKY75也参与了拟南芥低磷应答调控。已有研究表明拟南芥低磷应答中WRKY75调控的下游基因与PHR1调控的下游基因存在部分重叠,但是到目前为止这两个转录因子在低磷应答过程中的功能差异还不清楚。本论文主要通过PHR1和WRKY75基因组织表达差异,两基因过量表达株系和两基因功能缺失突变体在拟南芥生长发育及低磷应答中的表型差异来分析PHR1与WRKY75在拟南芥低磷应答及生长发育过程中的角色分工,为解析植物低磷应答磷吸收及体内磷营养平衡分子调控网络提供理论数据。本论文主要研究结果如下:1.拟南芥生长发育过程中PHR1、WRKY75基因具有不同的表达模式以PHR1p:GUS和WRKY75p:GUS转基因拟南芥为材料分析了两基因启动子活性差异。GUS染色结果显示PHR1基因在拟南芥幼苗期根中及生命活动旺盛的组织表达活性较高,在衰老组织中活性减弱。而WRKY75基因启动子活性刚好相反,在幼苗期和根尖信号十分微弱,在成苗期及衰老的叶片中活性较强。qRT-PCR检测PHR1和WRKY75基因在拟南芥生长发育过程中的表达结果与启动子活性分析一致。实验结果显示PHR1和WRKY75拟南芥生长发育过程中可能扮演不同的功能。2.低磷条件下,PHR1、WRKY75基因具有不同的表达模式对PHR1p:GUS和WRKY75p:GUS转基因拟南芥进行低磷胁迫处理后,GUS活性检测结果显示在低磷条件下,在拟南芥整个根中PHR1基因启动子活性增强;而WRKY75基因启动子活性仅在拟南芥根上部有一定水平的增强,在根尖部活性不受低磷诱导。qRT-PCR实验也显示低磷胁迫下PHR1与WRKY75基因表达均上调。这些结果说明虽然低磷胁迫诱导PHR1和WRKY75基因表达,但两者诱导的部位存在差异。3.PHR1、WRKY75基因对拟南芥生长发育具有不同的影响分别获得了RHR1、WRKY75过量表达转基因拟南芥及phr1、wrky75基因功能缺失突变体。在高磷和低磷条件下,两基因过量表达均能促进拟南芥从外界获取磷,导致体内磷含量提高。在低磷条件下,PHR1过量表达促进了花青素的积累,而WRKY75过量表达降低了花青素积累;phr1突变体中磷吸收能力及花青素积累均被降低,而wrky75突变体中磷的吸收没有明显影响,花青素的积累升高。但是在进入衰老的叶片中,wrky75突变体中磷含量相比野生型要高。低磷条件下PHR1、WRKY75双过量表达转基因拟南芥表现为花青素积累增加,phr1 wrky75双突变体表现为花青素积累减弱,这些结果显示WRKY75基因过量表达及突变对花青素的影响是通过PHR1基因的功能来实现的。4.PHR1、WRKY75通过调控不同的磷转运蛋白来协调磷的吸收和体内平衡qRT-PCR结果显示在拟南芥中过量表达PHR1、WRKY75均能提高磷转运蛋白基因Pht1;1/PT1、Pht1;4/PT2、Pht1;5/PT5表达。低磷条件下,phr1突变体中Pht1;1/PT1、Pht1;4/PT2表达下降,Pht1;5/PT5表达没有明显影响;wrky75突变体中Pht1;5/PT5表达下降,尤其在wrky75突变体衰老叶片中Pht1;5/PT5表达显著下降,而Pht1;1/PT1、Pht1;4/PT2表达没有明显变化。在phr1 wrky75突变体中Pht1;1/PT1、Pht1;4/PT2、Pht1;5/PT5基因表达均明显下调。这些结果表明,低磷条件下PHR1正调控Pht1;1/PT1、Pht1;4/PT2基因从而促进拟南芥从外界获取磷的能力,而WRKY75可能在拟南芥体内磷的平衡中发挥作用,例如促进磷从衰老叶片向幼嫩组织的转运。5.WRKY75通过促进SA的合成生成抑制PHR1基因qRT-PCR结果显示低磷条件下OEWRKY75过量表达转基因拟南芥中PHR1基因表达被下调,而PHR1基因过量表达对WRKY75基因表达没有明显影响。低磷条件下,WRKY75过量表达转基因拟南芥及其突变体中花青素积累的改变是依赖于PHR1的功能。体外SA处理表明,无论在高磷或低磷条件下,拟南芥中PHR1启动子活性受到SA的抑制。qRT-PCR检测PHR1基因表达结果与启动子活性分析一致。OEWRKY75过量表达转基因拟南芥中SA含量明显上升,而wrky75突变体中SA含量明显下降,说明OEWRKY75过量表达拟南芥中WRKY75通过促进SA的合成来抑制PHR1基因表达。6.WRKY75通过SA抑制生长素信号SA处理拟南芥生长素信号株系DR5:GUS和IAA:GUS实验发现,SA能够降低Auxin应答信号。OEWRKY75过量表达转基因拟南芥中生长素含量降低,而wrky75突变体中生长素含量与野生型没有明显差异。这些结果表明WRKY75过量表达对PHR1表达的抑制是通过生长素信号减弱来实现的。7.生长素抑制WRKY75基因表达体外生长素处理WRKY75p:GUS转基因拟南芥发现,生长素能够抑制WRKY75基因启动子活性,而生长素运输抑制剂NPA处理可以提高WRKY75基因启动子活性。qRT-PCR表达分析也表明生长素可以抑制WRKY75基因表达。这些结果与WRKY75在拟南芥生长发育活跃部位表达较低相一致。综上所述,在拟南芥生长发育早期及发育活跃组织中,生长素含量高,促进了PHR1基因表达,抑制WRKY75基因表达,PHR1通过正调控Pht1;1/PT1、Pht1;4/PT2等高亲和性磷转运蛋白从而提高植物从外界获取磷的能力。在拟南芥衰老组织中,WRKY75表达上调并促进SA的生成,抑制生长素信号,PHR1基因表达也收到抑制。此时,WRKY75可能通过正调控Pht1;5/PT5将磷从衰老组织运出。