神经型一氧化氮合酶SUMO化在突触可塑性中的作用

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目的突触可塑性是指突触结构和功能的可变性。突触功能可塑性有两种重要的表现形式,即长时程增强(long-term potentiation, LTP)和长时程抑制(long-term depression, LTD),是学习记忆活动在细胞水平的生物学基础。神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)催化产生的NO参与突触可塑性LTP调控,但是nNOS在LTP中的作用及调控分子机制仍未阐明。SUMO化是蛋白质翻译后修饰方式,近年来研究表明SUMO化参与多种神经功能调节。nNOS是突触后膜PSD-95信号复合体中的重要信号蛋白,并且研究发现SUMO连接酶PIAS3在突触后膜表达并高度富集。因此,本课题主要就nNOS SUMO化对突触可塑性的调控展开研究。方法采用Bicuculline(50 μM)和KCl(50 mM)作用体外培养的原代皮质神经元,构建LTP细胞模型;采用免疫沉淀和免疫印迹的方法检测nNOS SUMO化水平的改变、nNOS与PIAS蛋白的相互结合;采用细胞免疫荧光技术观察nNOS与SUMO1、PIAS3在神经元中的共定位情况;利用分子生物学技术和PCR定点突变技术来鉴定nNOS SUMO化的位点;采用分子生物学手段,构建nNOS、PIAS3不同结构域缺失的突变体,来检测nNOS与PIAS3的相互作用的结构基础;应用特异性小肽干预nNOS与PIAS3的相互结合,研究nNOS的SUMO化在LTP中的作用及机制;应用脑片膜片钳记录场电位观察小肽对LTP的作用。结果 1、在大鼠海马组织可检测到nNOS能够与SUMO1共价结合。2、nNOS的SUMO化水平随着Bicuculline作用时间延长而逐渐升高,NMDA受体特异性拮抗剂MK801可显著抑制Bicuculline诱导的SUMO化水平的增高,而nNOS SUMO化则只在KCl作用后检测到短暂性的升高。3、nNOS CaM结合结构域内K725R和K739R(赖氨酸K突变为精氨酸R)单点突变体SUMO化水平低于nNOS野生型组,并且K725/739R的双点突变体组NOS SUMO化水平与野生型组相比显著降低。4、在Bicuculline作用后可检测到nNOS与SUMO连接酶PIAS3的相互作用明显升高,其变化趋势与nNOS的SUMO化变化情况相一致。5、在COS7细胞,PIAS3 SAP结构域(1-86 aa)能够与nNOS相互结合,nNOS的CaM结合结构域(CaMB, nNOS 721-756 aa)可与PIAS3结合,过表达nNOS的CaM结合结构域可显著抑制nNOS与PIAS3的相互结合。6、小肽Tat-CaMB可抑制Bicuculline作用后nNOS的SUMO化、ERK1/2的磷酸化、Elkl的磷酸化、Arc和BDNF的蛋白表达。7、小肽CaMB可显著干预LTP的诱导。结论大鼠海马nNOS能够发生SUMO化;nNOS SUMO化在LTP中有重要作用;nNOS SUMO化的主要位点为CaM结合结构域内第725和739位赖氨酸残基;PIAS3为主要参与nNOS SUMO化的SUMO连接酶;nNOS SUMO化后可激活ERK1/2,促进转录因子Elkl的活化,并上调可塑性相关蛋白Arc、BDNF的表达,参与LTP的诱导。nNOS SUMO化调控机制的阐明有望为治疗学习记忆功能障碍相关疾病提供理论依据。
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