目的 神经干细胞具有增殖和分化能力，为神经系统损伤和退行性病变的治疗带来了希望，其目前的关键问题是神经干细胞定向分化的诱导。本研究旨在体外诱导神经干细胞定向分化为胆碱能神经元；探讨神经干细胞定向分化过程中突起生长机制。 本研究分3步进行。第一，分离、培养新生大鼠脊髓神经干细胞，加入NGF、IGF-1、胰岛素，观察此诱导因素是否使新生鼠脊髓神经干细胞定向分化为胆碱能神经元。 第二，探讨细胞骨架蛋白-β-微管蛋白(β-tubulin)在脊髓神经干细胞分化为神经元过程中的表达及意义。神经细胞发育过程中，细胞生长、迁移、轴突和树突的发出，把大分子物质和细胞器运送到其突起的分支以及轴突与其他神经细胞建立突触联系等，均与细胞骨架有关。我们已知，神经元中最丰富的骨架蛋白是β微管蛋白(β-tubulin)。因此，β-tubulin表达的时空变化，可为神经干细胞的定向分化研究提供重要依据。文献报道β-catenin可能与神经元轴突的早期生长有关。因此，结合β-catenin能更好地揭示神经元发育过程中的突起生长机制。 第三，跟踪观察突起生长锥中高表达的GAP-43在神经干细胞定向分化过程中的表达变化，同时用共焦激光扫描显微镜(Confocal Laser ScanningMicroscope，CLSM)观察β-tubulin和GAP-43在突起生长中的相互关系。CLSM能进行细胞CT，精确地检测和识别β-tubulin和GAP-43在神经元内的分布部位和表达程度。从其表达的三维空间结构，可进一步揭示神经元突起生长中β-tubulin和GAP-43的相互关系及其作用。 材料与方法 1．新生大鼠脊髓神经干细胞的分离、增殖及传代取新生24h内的Wistar大鼠，无菌取脊髓，剪碎、消化、离心，用DMEWF12无血清培养基(含B27、bFGF、EGF)悬浮培养。培养7日后，收集细胞集落，机械吹打成单细胞悬液，种植到%孔培养板中进行培养。每隔7日，新形成的细胞集落用同样的方法传代，连续传代4次，得到的细胞集落用Nestin免疫组织化学方法进行鉴定。 2.脊髓神经干细胞的定向分化及鉴定 将原代和继代培养得到的悬浮生长的细胞集落离心后，吹打成单细胞，种植在置有盖玻片及用于电镜的AC以R膜的6孔培养皿中，培养孔分为实验组和对照组两组:对照组添加含有10%胎牛血清的DMEM夕nZ培养基;实验组添加含有NGF、IcF一1、胰岛素、10%胎牛血清的DM[EM刀八2培养基进行培养。用NSE免疫组织化学染色和镀银染色方法鉴定神经元。在分化7日时对照组和实验组各取10张经NSE免疫染色的盖玻片，经苏木素复染后，进行细胞计数。高倍镜(40x)下，每张各取10个视野，连续计数总细胞数和NsE阳性细胞数，统计神经元的比例，对比对照组和实验组的神经元产生比例。 3.免疫组化sABC法及免疫荧光法染色 加人诱导因素后1、4、7日，取长有细胞的盖玻片，用4%多聚甲醛固定，分别进行AchE、p询山山n、日.Cate‘n、CAp43的免疫组化SABC法、免疫荧光法染色，同时用长有细胞的ACLAR膜进行它们的免疫电镜染色，以观察AchE、p一tubulin、日一catenin、CAp43在这一时程中的表达变化。在光学显微镜、荧光显微镜及电子显微镜下观察、照像。 4.免疫荧光双标记技术 加人诱导因素1、4、7日时，取出盖玻片，4%多聚甲醛固定20而n，混合血清封闭非特异性染色，一抗孵育:滴加混合的一抗工作液口廿43(l:2oo)、p枷山记in(1，300)，湿室，4℃过夜，二抗孵育:T改aS~R记标记p-t吐)u，lin(红)，月叮C标记GAp43(绿)，滴加混合二抗，在湿室室沮孵育45面n，PBS洗5而n x3，封片，C此M[4 88川.咫沁 3lun双通道激发，观察结果，并摄像。实验结果 1.脊髓神经干细胞的培养及鉴定 培养24h后，形成含有5一10个细胞的细胞集落即神经球，以后细胞集落不断增大，增多。到第7日时，可观察到很多悬浮的大的神经球，集落细胞可达数百个，细胞集落呈球形、桑堪状，折光性强。传代之后，能看到培养孔内单个细胞逐渐增殖，细胞集落增大，形成新的神经球。光电镜观察，可见神经球内小圆形细胞nestin呈强阳性，核无着色，细胞核占的比例很大。 2.脊髓神经干细胞的定向分化结果及神经元的鉴定 神经干细胞分化后，实验组和对照组细胞都迅速贴壁，开始发出突起。实验组细胞在刚贴壁的24小时内有细胞增殖现象，故常可观察到成堆的细胞，但两者细胞形态无明显差别。进行NsE免疫染色后，实验组可见较多的NSE阳性细胞，但NSE在细胞内的分布实验组和对照组都一致。分化第4、7日，实验组和对照组都可观察到NSE阳性的细胞，棕色的反应产物在细胞质中均匀分布，核膜上也有阳性分布。对照组细胞连续计数共523个，NSE阳性细胞161个，神经元的含量为30.8%。实验组细胞连续计数共722个，其中NSE阳性细胞269个，神经元的比例为37.3%。 镀银染色后，神经元原纤维呈现黑色，分布在神经元的核周质及突起中。 3.免疫组化染色 ACHE:光镜下，第4日可见近核处ACHE反应产物密集，到第7日，ACHE阳性反应分布于突起处，表达增强。 电镜下，可?