慢性乙型肝炎是我国的高发疾病之一，是导致肝纤维化和肝癌的主要原因。目前治疗慢性乙型肝炎的药物主要是以拉米呋啶和阿的福韦等核苷类似物为主的抗病毒药物和以α干扰素为主的免疫调节剂，但是临床治疗效果不甚满意。 RNA干扰是近年来生命科学的一个重大发现，其原理是同源双链RNA导入宿主细胞，通过对目标基因mRNA的特异性切割或降解作用，导致目标基因的不表达或减效表达。该现象是转录后基因沉默的一个重要机制，也是一种古老的抵御外来病原侵入的防御机制，在植物，线虫，果蝇和哺乳动物中广泛存在。在成熟的哺乳动物细胞中，超过30核苷酸的长双链RNA激活蛋白激酶R(PKR)和2-5’寡腺苷酸(OAS)途径，引起干扰素样的非特异性抑制，而不能引起高效特异的基因沉默，并不能特异有效的抑制同源基因的表达，这使得RNA干扰在一段时间内没有更好的推广。2001年Tuschl研究小组证实21个核苷酸长度的小双链干扰RNA(small interfering RNA．siRNA)导入哺乳动物细胞，能引起同源的内源基因的表达沉默，从而使RNA干扰技术开始走向人类疾病的实验治疗研究。RNA干扰具有高效，特异，快速，无明显副作用等优点，很快被应用于抗病毒，生物体基因的表达，调控和功能分析。在抗(?)-1，脊髓灰质炎病毒，流感病毒等人类致病病毒 浙江大学博士学位论文的实验研究中均取得较理想的结果，在转录后水平显著抑制病毒的复制和蛋白表达柞用强度远远超过了反义核酸和核酶技术。 HBV的复制是一个DNA一RNA一DNA的过程，其中HBV的前基因组RNA逆转录成正链CDNA，和单链DNA转变为双链松弛DNA的步骤，均在细胞浆内进行因此可能成为RNA于扰的个很好的靶点。 本.实验胜要目的是研究R卜A千扰在抗HBV中的作用。首先初步建立载体法筛选、IRN八的模型:利用绿荧光蛋白(EGFP)报告基因的特征，构建目的基因和F曰干融合基因表达载体，同时设计针对HBV基因组序列的ShRN八，构建、hRN八表任载体，在哺乳细胞中筛选、iRNA靶位，为今后RNA一干扰相关研究打卜基础其次，在川飞V持续复制和病毒蛋白表达的细胞模型一HePG2.215细胞中观察研究R卜八卜扰对病毒复制和蛋白表达的影响，同时进一步验证靶位的有效性〕论文一有效siRNA筛选体系的建立1 .E(，FP和HBs融合基因组载体(pEGFP一S)的构建和功能鉴定 次pd)NA3.l十S载体为模板，设计一对引物，高保真PCR法扩一增不含终l卜密‘，马的全长HBs基因片段，经双酶切连接后，融合到pEGI了PN一!载体FGFP基因的端，然后通过特异性I“CI之反应、限制性内切酶酶切法及核酸序列测定方法筛选和鉴定有效克隆。浅R法和酶切法结果均表明插入片断与预期长度相符。序夕lj测序结果与衍enbank相‘、女序列吻合。重组质粒DNA转染日ePGZ细胞后，24小时后丁以观察到绿荧光的表达，提示该载体可以作为动态监测融合蛋白变化的模型2.不司靶位和发夹结构的、hR八表达载体的构建 利用如:二n以在线、、R卜八搜索和设计工具，针对HBVS基因序列选择并设计由})N入片断，插入pAU6十夕载体的U6十27 RNA启动子后端，构建成劝R八表达载体一pCR法和核酸测序万法筛选和鉴定有效克隆。测序纪果与预期一致。飞.洲:}一曰厂}’融合蛋门荧光表达的检测 p‘心fP一S分别和不同位点的shRNA表达载体DNA脂质体法共转染/l)293细饱，轩染后24一72}:，使用倒置荧光显微镜观察绿色荧光细胞表达的情沉，流式细 浙江大学博士学位论文胞仪检测细胞总荧光强度。镜厂观察到不同组细胞的绿荧光蛋白川3、一以洲”较空载体和无关对照组表达强度均减弱，荧光细胞数减少;转染72小时后，。AVU6+1、卜123〔，、「)八冷64、、。:飞洒、泌训6、4、为5了，和t)AVu6月一4、h691组细胞荧光相对表达率较空载体对照组分别降低56.2%、招.了%、胡.8%和63.1%，而无关对照组较空载体对照组_无明显:文变}‘，}片;队日，融合基因:二RNA表达水平的检测 共转染后72小时，收获细胞，抽提细胞RNA及逆转录，普通半定量逆转录一聚合酶链反应(Rl七PCR)法检测不同组对HBs一EGFP融合基因mRNA的影响。R’卜尸(R泄;显示不同位点的ShRN八表达载体对HBS一EGFP rnRNA的表达的影响有 任买毛异一第239、359对HBS一于一(，「P mRNA的抑制率分别为69.67叭，、73，2%、74.7%和 64，‘7%，宾中579位点的抑制效果最好，无关序列和空载体的作用无明显差别同时采用荧纪染料法对f八;l户车::15了9组细胞进行实时荧光定量P(’R检测，结果显示几价丫卜斤:、「飞579组较空载体纷显著抑制l招、一巨(;l}’融合基因m朋了、的表达，抑制率达到川呢5.小1司发少、结构的、hRNA对RNAi的影响 分对同位点的不同发夹结构的shRNA表达载体转染HePGZ一2.!5细胞后，荧光、〔量P(R检测HBv。x)N八水平的变化。4、9、1‘)个核营酸〔，飞uele、)tide，11t)结构、hR卜A表达载体组抑制附丫1价八的表达，抑制率分别为沛.}‘%，、!4艺%和6丫.当，结喂发现小·?