骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein,BMP)是一类低分子量酸性多肽，能够诱导未分化的间充质细胞向软骨，骨细胞分化，形成新生的软骨和骨组织。除BMP-1外，都属于转化生长因子β(TGF-β)超家族成员。BMP至少包括20个成员，其中BMP-2是迄今所研究过的BMP家族中骨诱导活性最强且唯一能单独诱导成骨的因子。有文献报道：BMP家族的某些成员与机体肿瘤的发生、发展及转移有关，其中与BMP关系最为密切的是骨肿瘤；在骨肉瘤、软骨肉瘤等骨肿瘤中均可检测到BMP的丰富表达；BMP的存在与骨肉瘤的不良预后密切相关；产生BMP的骨肉瘤与不产生BMP的骨肉瘤二者的临床特征有不同之处；BMP在成骨活跃的恶性肿瘤细胞中有较强的表达，恶性骨肿瘤中的BMP总含量是良性骨肿瘤的3.4倍。口腔颌面部的骨肿瘤种类复杂。关于BMP与颌骨肿瘤的关系，目前尚缺乏全面系统的研究。本课题针对BMP家族成员中与骨肿瘤关系最为密切、作用亦最为重要的BMP-2进行研究。 本课题研究目的：(1)研究BMP-2及其mRNA在各类常见颌骨肿瘤中的表达特点；(2)研究含硬组织领骨肿瘤与不含硬组织领骨肿瘤中BMP-2及其mRNA的表达差异，并分析其意义；(3)研究颌骨牙源性 贺江大学硕士学位论文 肿瘤中BMP毛及其W的表达特点，蛐其与肿瘤组织起源之间的 关系；（4）研究成釉细胞瘤中BMP－2及其mRNA的表达，分析成釉细 胞瘤中不合硬组织的原困；（5）研究颌骨骨肉瘤中BMPZ瞅InRNA 的表达，研究其与肿瘤淋巳转移的关系；（6）雌骨外伤组织标本中克 隆人 BMP－2成熟肽编码区基囚片段，并合成人 BMP－ZcDNA探针，进行 B MPMPK 表达的原位杂交研究。 材料与方法 1．选取临床资料完整的颌骨肿瘤标本吕类＊ 例，其中新鲜标本70例， 作提取总RNA、RT4，gnR、原位杂交和免疫组化用．存档标本43 N作原 位杂交和免疫组化用．另取新鲜颌骨外伤组织标本1例（系儿童保状突 栓骨折游离的骨组织块）合成人BMP－ZcDNA J＄H用．并收集年龄、 性别、部位、淋巴转移等资料。 2．采用逆转录聚合酶链式反应（everse Nipip…erase chain reachon，RTFCR厂 原位杂交忡 st恤 bybid咖ion）和免疫组化 （nnmunohistOChemisny）等方法，检测吕类 113例颌骨肿瘤中 BMP上 基困的扩增、BMP．ZWA和蛋白质的表达． 原位杂交评价标准（参照J．萨姆布鲁克，El弗里奇《分子克隆实验 指南》）： 阳性标准：细胞胞浆中有蓝黑色颗粒状染色。 阴性标准：细胞胞浆中均无蓝黑色葡粒状染色。 免疫组化评价标准（参照美国 Santa Cruz公司羊抗人 BMP－2多克隆 抗体试剂盒说明）： 阳性标准：胞浆或核周或细胞外基质中有棕黄色颗粒状染色。 阴性标准：胞浆或核周或细胞外基质中均无棕黄色颗粒状染色． 3．利用图像分析系统计数每组细胞中BMP－2的平均染色灰度值，以确 ．2． 沂江大学硕士学位论文 定细胞中 BMPZ的相对舍量．采用 SPSSS．0 for W’Ws统计懈包分 析数据．颌骨肿瘤间BMPZ的相对合量比较单因素方差分析检验．颌骨 骨肉瘤中 BMP毛及 WA表达与淋巴结转移间的关系用卡方陇． ＃1 1．新鲜组织标本总RNARt结果： 所有70例新鲜颌骨肿瘤组织标本和1例颌骨外伤组织标本，总RNA 电泳均显示三条清晰的特征性条带：5．SS、18s、285，未见明显降解， 无基因组DNA A杂．A260lA280 k匕值为 l．75 t 0．12，总 lw ＄L为 216．8 110．20po．结肚明，总IDqAMtt量栅，完全符合RT札R的 要求． 二．RT－PCR后电泳结果： 颌骨外伤组织标本显示清晰的308hP特异性扩增条带，未见杂带． 70N新鲜颌骨肿瘤组织标本中部分显示308hp特异性扩增条带，部分未 见308hp特异性扩增条带．其中含硬组织的ZI例颌骨肿瘤均显示人 BMP－2特异性扩增条带（100％）；＆＄hi组织的49例颌骨肿瘤，除31 例咸釉细胞瘤中有 27例显示人 B衅2特异性扩增条带O7．10叨，其它 均未见特异性扩增条带． 3．重组质粒抽提产物经酶切后电泳： 重毗粒抽提产物经 EcOR t4切后，电泳显示两条条带：308hp 的 x s皿z con片段和 s00abp的仰vx质粒片段，表明重组体 叶进M－TW B皿毛的构建成功．