研究背景:静脉血栓主要包括深静脉血栓形成和肺栓塞,欧美国家每年静脉血栓的发病率为每10万普通人群中有100-200人。我国目前缺乏准确的数据统计。静脉血栓是血管外科常见疾病,随着人们生活水平的提高,近年来发病率显著上升。静脉血栓常引起血栓后综合症(postthrombotic syndrome),使治疗费用高,疗效差。目前国内外静脉血栓的治疗主要是抗凝和溶栓非手术措施。抗凝治疗不能去除已经形成的血栓,溶栓治疗只对血栓的表面部分有效,其溶栓作用相当有限,溶栓治疗并不能减轻血栓后综合症的严重程度,溶栓和抗凝治疗有导致严重出血的风险。机体内静脉血栓的最终吸收和溶解主要是依赖于机体本身的慢性自然溶解机制。机体对静脉血栓的吸收和溶解即是血栓的机化过程。随着血栓的溶解,中性粒细胞、单核细胞和内皮细胞进入血栓中。血栓机化后,血栓内新生血管形成和接合并增大形成管道,血流通过管道而实现血管的长期再通。如果机体对血栓的吸收和溶解彻底,血管可完全再通,否则出现血管狭窄或闭塞,血液倒流,引起血栓后综合症。增加血栓的机化和血管新生可减轻静脉瓣膜的损害和阻塞,预防血栓后综合症的发生,对于溶栓治疗有禁忌症时尤为重要。目前研究发现,巨噬细胞在血栓的溶解和再通中有重要作用,血栓中注入巨噬细胞增强了血栓的溶解和再通。在人和动物的血栓中均发现,血栓中的新生血管主要出现在巨噬细胞集中的区域。最近研究显示,骨髓来源的细胞参与了血栓的溶解和吸收。血栓溶解时,表达内皮标记的骨髓祖细胞在术后7d出现在血栓的周边区域,14d时贯穿于血栓的整个区域,同时这些细胞表达巨噬细胞标记物CD68,但是骨髓来源的祖细胞并未排列在血栓内的以及血栓与血管壁之间形成的再生管腔表面。骨髓中的祖细胞可能并不是直接分化为血管内皮细胞而形成新生血管,而是刺激了血栓溶解的再生血管过程。半胱胺酸-半胱胺酸趋化因子受体2(CCR2)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)对于单核细胞的动员极为重要。CCR2基因敲除抑制单核细胞在血栓的聚集和血栓的溶解,血栓形成增大,血栓中胶原增加,巨噬细胞数量减少,MMP2和9活性降低。趋化因子MCP-1对单核细胞在血栓中的归巢没有影响。因此我们设想,若能主动增加血栓中骨髓来源的祖细胞的聚积及功能,一定有助于促进血栓的溶解及新生血管形成,实现血管的早期再通,减少血栓后综合症的发生。本研究拟探讨骨髓细胞动员对静脉血栓溶解和再通的作用及可能机理。研究方法:1动物实验Sprague-Dawley雄性大鼠随机分为正常组、假手术组、血栓组和骨髓动员组。正常组未行任何处理。假手术组大鼠的下腔静脉未行缩窄及阻断,余处理同血栓组。骨髓动员组为模型鼠术后当d开始连续7d在腹部皮下按25ug/kg注射rhG-CSF或rhGM-CSF,其余组注射等体积生理盐水。大鼠静脉血栓模型的建立参照Modarai方法加以改进。显露左肾静脉以下下腔静脉至左右髂总静脉汇合处,离断并结扎该段下腔静脉属支,神经血管钳阻断下腔静脉1min,松开30s,再阻断1min,顺下腔静脉放置头皮针头,以4-0丝线于左肾静脉下方结扎下腔静脉和头皮针头,取出头皮针头,缝合腹壁。术后动物自由饮水,正常饲养。术后7d取血栓组和骨髓动员组下腔静脉标本,术后14d取假手术组、血栓组和骨髓动员组下腔静脉标本。切取左肾静脉以下下腔静脉至左右髂总静脉汇合处,用于组织形态学和免疫组化观察。术前0.5h,术后1、3、5、7和10d采集外周血,以全自动血细胞计数分析仪检测白细胞总数,血涂片显微镜下计数MNC比例。将4%多聚甲醛溶液中固定过夜的组织石蜡包埋,制成5μm厚的石蜡切片,于缩窄线以下开始切片,连续观察间隔50μm的血栓病理组织切片3张,于显微镜下选定、摄取血栓的图像,图像分析系统测定每张切片中血栓机化部分的面积和血栓总面积,计算二者比值的百分数,算出3张切片的平均百分数,即为该标本的血栓机化率。用CD68单抗定位血栓中巨噬细胞,图像分析系统算出血栓的巨噬细胞密度。电镜观察血栓的超微结构。外周血中MCP-1和MIP-1α水平用ELISA法检测,操作分别按大鼠MCP-1 ELISA Kit (BioSource)和大鼠MIP-1αELISA Kit (Antigenix)说明书进行。外周血总RNA提取按Catrimox-14TM RNA Isolation Kit Ver. 2.11(TaKaRa公司)的说明步骤进行。RT-PCR扩增参照TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒操作说明书进行。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳,溴乙啶染色。OD值行半定量检测。2细胞实验小鼠腹腔巨噬细胞株RAW264.7培养于含10%的小牛血清、100u/ml青霉素和100μg /ml链霉素的RPMI-1640培养液中。培养液中加入终浓度为0、20、40、80、160、320ng/ml的rhG-CSF或rhGM-CSF。1×105个细胞接种于24孔培养板,6×105个细胞接种于100ml培养瓶。ELISA检测培养液中MCP-1和MIP-1α的水平,操作分别按小鼠MCP-1 ELISA Kit (Pierce)和小鼠MIP-1αELISA Kit (Biosource)说明书进行。培养的RAW264.7细胞总RNA提取按Catrimox-14TM RNA Isolation Kit Ver. 2.11(TaKaRa公司)的说明步骤进行。RT-PCR扩增参照TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒操作说明书进行。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳,溴乙啶染色。OD值行半定量检测。按试剂盒说明提取RAW264.7细胞总蛋白。为防止磷酸酶的激活,所有的步骤均在冰上进行并加磷酸酶抑制剂。按BCA蛋白质定量试剂盒说明书进行蛋白定量。等量蛋白加样于12%的聚丙烯酰胺凝胶后60mA下电泳,电转膜至PVDF膜上。TTBS封闭1h,1:1,000抗CCR2抗体孵育,洗膜,1:5,000 HRP结合的兔抗羊IgG抗体孵育。内参照GAPDH的检测同上述方法。结果以DAB显色,OD值行半定量检测。3统计分析采用SPSS10.0统计软件对数据资料进行统计分析。所有数据根据具体资料采用F检验、Dunnett检验、tukey’s检验或t检验。以P值﹤0.05为差异有显著性。结果:1外周血MNC计数术后第3、5和7d,与血栓组(1.7±0.2,1.5±0.3,1.3±0.4)比较,骨髓动员组外周血MNC计数(rhG-CSF:2.1±0.3,3.1±0.2,4.4±0.3; rhGM-CSF: 1.8±0.3,2.4±0.6,3.0±0.7)升高有显著性差异。与rhGM-CSF骨髓动员组比较,术后第5d(t=2.95,P<0.05)和7d(t=3.53,P<0.01),rhG-CSF骨髓动员组升高有显著性差异。2血栓机化率和电镜结果术后7d和14d,与血栓组(15.6±2.3%, 63.2±8.6%)比较,骨髓动员组血栓的机化率(30.2±3.5%, 89.5±5.6%)有显著性差异(P﹤0.01)。骨髓动员组中rhG-CSF和rhGM-CSF之间血栓机化率差异无显著性。电镜观察显示:与血栓组比较,骨髓动员组(rhG-CSF或rhGM-CSF),巨噬细胞数量多,其周围常见新生幼稚血管和成熟再通血管,巨噬细胞吞噬功能活跃。3巨噬细胞密度术后第7d,与血栓组血栓内巨噬细胞密度(1.47±0.8%)比较,rhG-CSF骨髓动员组(8.46±1.2%,P=0.0026)和rhGM-CSF骨髓动员组(7.84±1.1%,P=0.0041)均显著升高。术后第14d,血栓组血栓内巨噬细胞密度为5.52±0.7%,rhG-CSF骨髓动员组为13.52±1.3%(P=0.0087),rhGM-CSF骨髓动员组为12.13±1.4%(P=0.0092)。术后第7d和14d,rhG-CSF和rhGM-CSF骨髓动员组之间血栓内巨噬细胞密度无显著性差异。4 MCP-1和MIP-1α水平大鼠外周血MCP-1和MIP-1α水平分别在术后7d和14d不同时点之间以及在相同时点不同组间均没有显著性差异。rhG-CSF或rhGM-CSF处理后,RAW264.7细胞分泌的MCP-1和MIP-1α水平没有显著性变化。5 CCR2 mRNA表达与正常组比较,假手术组、血栓组和骨髓动员组术后7和14d CCR2 mRNA水平显著升高(P﹤0.05)。骨髓动员组术后7和14d CCR2 mRNA水平均较血栓组显著升高(P﹤0.05)。骨髓动员组rhGM-CSF和rhGM-CSF之间CCR2 mRNA水平无显著性差异。80ng/ml rhGM-CSF或rhG-CSF对RAW264.7细胞CCR2 mRNA的表达促进作用最强。RAW264.7细胞在80ng/ml rhGM-CSF或rhG-CSF培养36和48h后其CCR2 mRNA的表达稳定增强,在培养12h后,rhGM-CSF对RAW264.7细胞CCR2 mRNA表达的促进作用强于rhG-CSF。6 CCR2蛋白表达80ng/ml rhGM-CSF对RAW264.7细胞CCR2蛋白的表达促进作用最强。RAW264.7细胞在80ng/ml rhGM-CSF中分别培养36、48和60h后其细胞CCR2蛋白的表达逐渐增加。rhG-CSF对RAW264.7细胞CCR2蛋白的表达未见影响。结论:1.静脉壁机械性损伤联合缩窄可稳定建立大鼠静脉血栓模型。2.骨髓细胞动员促进血栓的溶解、再通和巨噬细胞在血栓中的聚集。3.rhGM-CSF或rhG-CSF可增加巨噬细胞趋化因子受体CCR2的表达。4.rhGM-CSF或rhG-CSF动员骨髓细胞后血栓中巨噬细胞的增加可能与单核-巨噬细胞趋化因子受体CCR2表达的增加有关。