利用示踪标记法研究hUC-MSCs在治疗大鼠骨关节炎中的分布情况

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【目的】  比较绿色荧光蛋白( Green fluorescent protein, GFP )和 F-ara-EdU ( (2′S)-2′-deoxy-2′-fluoro-5-ethynyluridine )对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-drived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)的标记效率,选取其中更适合的一种示踪剂,利用示踪标记法观察hUC-MSCs在治疗大鼠骨关节炎中的分布情况。  【方法】  分离培养hUC-MSCs,单层培养扩增至P3代,通过流式细胞仪鉴定其表面标志分子;分别用不同浓度的GFP慢病毒和F-ara-EdU转染hUC-MSCs,用荧光显微镜及共聚焦显微镜确定两种示踪剂的最适浓度及转染后荧光信号的持续时间;利用CCK-8检测GFP慢病毒和F-ara-EdU是否影响细胞的增殖;实时荧光定量qRT-PCR检测SOX9、Aggreacan、Col2a1 mRNA表达;离断大鼠膝关节半月板前角及内侧副韧带,制备大鼠内侧半月板去稳定(destabilization of the medial meniscus,DMM)模型;分别在关节腔注射细胞后的1天、1周、2周、3周收集样本,对收集到的组织进行HE染色、免疫组化,观察注射的hUC-MSCs分布情况。  【结果】  成功分离、培养及鉴定hUC-MSCs,GFP慢病毒的最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI)为 50 , F-ara-EdU 的最佳浓度为 10uM。F-ara-EdU 转染hUC-MSCs之后,荧光信号在第5天开始衰减,GFP的荧光信号在7天内无明显变化。GFP慢病毒及F-ara-EdU不会影响hUC-MSCs的增殖及成软骨基因表达。免疫组化结果显示,hUC-MSCs主要分布在大鼠模型膝关节的软骨损伤、半月板损伤及滑膜等部位。  【结论】  GFP慢病毒MOI=50,F-ara-EdU浓度为10uM时,对hUC-MSCs的转染效率最佳,且不影响细胞的增殖及成软骨基因表达。相对于F-ara-EdU,GFP慢病毒的标记效率更高,标记持续时间更长,更适合作为hUC-MSCs在大鼠骨关节炎模型分布的示踪。HE染色及免疫组化的结果显示,hUC-MSCs注射到骨关节炎模型大鼠关节腔后主要分布在软骨损伤、半月板损伤及滑膜等部位。
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