论文部分内容阅读
目的：制备透明质酸-纳米银复合物,研究其肿瘤细胞靶向性以及其抗肿瘤活性,探究其抗肿瘤细胞的作用机制,为纳米银在肿瘤治疗应用提供实验依据。方法：通过化学反应使透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)的羧基与五亚乙基六胺的氨基偶联,合成制备得到氨基化HA。并利用氨基化HA的还原性来制备纳米银(HA-AgNP)。由于HA能与肿瘤细胞表面高表达的CD44结合,可作为靶向配体,提高纳米银的肿瘤细胞靶向作用。HA-AgNP的理化表征及细胞学研究包括：采用马尔文粒径仪测定HA-AgNP的粒径和电位；用透射电子显微镜考察HA-AgNP的形态及分散均匀度；使用邻苯二胺衍生法检测银离子含量；使用热重分析法测定HA-AgNP的载药量；使用比浊法考察纳米粒在超纯水、PBS和培养基的稳定性；使用荧光显微镜观察肿瘤细胞对HA-AgNP的摄取作用；用MTT法考察HA-AgNP对肿瘤细胞的杀伤作用；用流式细胞仪定量检测细胞对HA-AgNP的摄取情况；用JC-1标记线粒体,观察HA-AgNP对肿瘤细胞线粒体膜电位的影响；PI染色法测定HA-AgNP对细胞周期的影响；使用MDC观察肿瘤细胞的自噬囊泡；HO/PI双染法检测HA-AgNP对肿瘤细胞凋亡作用；使用激光共聚焦显微镜观察HA-AgNP与肿瘤细胞CD44的相互作用。在所有的细胞实验中均采用蔗糖还原法制备的AgNP作为对照。结果：通过化学偶联成功制备了氨基化的HA,通过TNBS法测定其氨基含量,得其含量为1mMol/g,其修饰率为40%。在37℃的条件下与硝酸银反应生成HA-AgNP复合物,HA具有稳定剂和还原剂的双重作用,HA-AgNP的粒径为300nm左右,zeta电位为17.2mV。热重分析法得HA-AgNP的载药量为13.1%。且HA-AgNP在超纯水、PBS和培养基中能够稳定存在。细胞实验表明,HA-AgNP对CD44+的SW480细胞和CD44-的MCF-7细胞均具有高效的肿瘤杀伤作用,但SW480细胞优于MCF-7细胞。HA-AgNP能够与肿瘤细胞表面的CD44结合,并通过CD44介导内吞进入细胞,在细胞内引起线粒体膜电位下降,周期阻滞,细胞核固缩,从而抑制细胞增殖,最终导致细胞凋亡和自噬。结论：本研究制备的新型HA-AgNP可有效抑制肿瘤细胞增殖,尤其对并具有CD44+肿瘤细胞具有强烈的杀伤作用,其机制可能是通过引起线粒体膜电位下降,细胞核固缩,周期阻滞,最终细胞凋亡或者自噬引起细胞死亡,提示凋亡途径可能为线粒体途径。