双苄基异喹啉类生物碱是一类结构中含有两个苄基基团以及四氢异喹啉基团的生物碱,许多含有这类生物碱的植物在中国以及其他国家地区都是用来治疗疾病的传统药材。本文选择了5个结构类似并具有多种药理活性的双苄基异喹啉生物碱,分别是莲心碱、甲基莲心碱、异莲心碱、蝙蝠葛碱和汉防已碱作为研究对象,一方面应用建立的高表达乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein, BCRP)的LLC-PKl/BCRP细胞模型,研究这些生物碱与BCRP的相互作用,探究BCRP对它们的体内处置过程及药理活性的潜在影响；另一方面应用建立的WI-38/3A5细胞模型,研究CYP3A5对这些生物碱的代谢激活作用和在肺毒性中所起的作用,阐明这类生物碱产生肺毒性的机理。1. LLC-PK1/BCRP细胞模型的建立及其生物学特征为建立高表达BCRP的细胞模型,应用脂质体转染的方法将质粒pcDNA3.1(+)-BCRP转入LLC-PK1细胞。细胞经G418筛选后,采用细胞群体倍增试验、流式细胞术和Western blot等方法鉴定；以体外细胞毒试验,检测转基因细胞模型对米托蒽醌和阿霉素的耐药指数；用荧光倒置显微镜,检测其对荧光染料Hoechst33342的外排作用；并以GF120918为BCRP抑制剂,观察抑制剂对BCRP外排荧光染料的逆转作用。结果表明,LLC-PK1/BCRP细胞高表达BCRP蛋白；细胞群体倍增时间较亲本细胞略有延长；对米托葸醌和阿霉素的耐药指数分别增加至51.92倍和6.09倍；对荧光染料Hoechst33342的外排作用明显增强,且可被抑制剂GF120918逆转。因此高表达BCRP的猪肾小管上皮细胞—LLC-PK1/BCRP细胞构建成功,可作为进一步研究BCRP与药物相互作用的模型。2.五个双苄基异喹啉类生物碱与BCRP的相互作用本研究应用构建的LLC-PK1/BCRP细胞模型研究BCRP与5个生物碱的相互作用特性。体外研究结果可以提示BCRP在生物碱的体内处置过程中和药理活性的发挥中的潜在影响。我们通过MTT试验测定了5个生物碱对LLC-PK1和LLC-PK1/BCRP细胞的毒性,为后续实验的浓度设计提供依据；进行细胞积聚实验和双向转运实验来检验这5个生物碱是否为BCRP的底物。实验结果表明,这5个生物碱透过生物膜的能力并不强,除甲基莲心碱在最高浓度下(30μmol/L)的Papp值在5×10-6cm/s左右外,其余几个生物碱的Papp值均小于3.5×10-6cm/s。莲心碱是BCRP的底物,在双向转运实验中,低浓度下(10μmol/L),它的净外排比为2.87；但是随着给药浓度的升高,莲心碱的净外排比有所下降,提示BCRP对莲心碱的转运存在饱和现象；细胞积聚实验也显示莲心碱在LLC-PK1/BCRP细胞内的积聚量显著少于LLC-PK1细胞。蝙蝠葛碱是BCRP的弱底物,双向转运实验的净外排比在1.6左右,并且在LLC-PK1/BCRP细胞内的积聚量略少于LLC-PK1细胞。而异莲心碱、甲基莲心碱和汉防已碱均不是BCRP的底物。为在蛋白分子水平上揭示BCRP与这5个生物碱的相互作用情况,找出参与相互作用的氨基酸残基,进行了分子对接计算。计算结果显示,莲心碱与482位精氨酸残基和490位苏氨酸残基可各形成一条氢键；蝙蝠葛碱与BCRP有疏水相互作用。由此可知,BCRP可外排莲心碱和蝙蝠葛碱,对它们的药理活性和体内处置过程可能存在影响。3. CYP3A5在五个双苄基异喹啉类生物碱的代谢激活中的作用前期在动物上进行的组织分布研究表明,这5个生物碱在肺内的分布浓度均较高；蝙蝠葛碱和汉防已碱大剂量腹腔注射给药时可产生严重的肺毒性。可能是由于前期进行的关于甲基莲心碱、异莲心碱和莲心碱的研究给药剂量均较低,它们的肺毒性还未见报道。文献推测蝙蝠葛碱与汉防已碱的肺毒性与CYP3A酶介导的代谢激活相关,由于在肺内表达的CYP3A亚族的酶为CYP3A5,因此,为研究CYP3A5在蝙蝠葛碱等的肺毒性中所起的作用,建立了WI-38/3A5细胞模型。通过MTT、MTS和LDH试验,发现5个生物碱在WI-38/3A5细胞上的毒性均强于WI-38/Vector细胞,其中汉防已碱的毒性最强。通过检测细胞内ROS水平、GSH水平和细胞凋亡情况,发现CYP3A5在细胞内表达水平的升高,使汉防已碱对细胞的毒性增强。实验结果显示,转染CYP3A5基因的WI-38细胞加入汉防已碱处理后,细胞存活率更低,胞内ROS水平更高,GSH水平更低,细胞凋亡的情况更严重。这说明,CYP3A5参与了汉防已碱的代谢激活,是汉防已碱引起肺毒性的原因之一。由于莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱同蝙蝠葛碱和汉防已碱类似,分子结构中都含有对亚甲基苯酚基团,并且CYP3A5酶表达水平的升高也使得这3个生物碱的毒性增强,因此推测CYP3A5也可介导这3个生物碱的代谢激活。