论文部分内容阅读
目的:利用真核表达载体,构建携带有wild type p53(wtp53)和mutant type p53(mtp53)基因的重组质粒,转染获得稳定细胞株,观察癌细胞中wtp53和mtp53基因过表达是否会影响其增殖、凋亡、抗药性等功能,同时研究环境压力下p53蛋白及相关因子的亚细胞定位,从而阐明wtp53细胞定位与抗药性的关系。方法:重叠PCR法获取mtp53基因,构建真核重组质粒后转染细胞,筛选得稳定表达细胞株;MTT法检测环境压力下p53蛋白对细胞活性的调节作用;免疫荧光法观察压力环境下p53蛋白亚细胞定位的变化及p53蛋白与p53(phosphor-ser15)蛋白、Hsp60(Heat Shock Protein 60)蛋白共定位情况;琼脂糖凝胶阻滞实验检测p53蛋白与mtND2(mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 2)基因的相互关系和mtND2过表达细胞株功能实验;裸鼠肿瘤实验检测不同p53的耐药性及相关肿瘤因子的表达。结果:1、成功构建 pcDNA-mtp53(R175H、R273H、R282W)和 pcDNA-GFP-mtND2真核表达重组质粒,转染至HepG2及Hela细胞中,G418药物筛选获得单克隆的稳定转染细胞株。2、环境压力下(低营养条件、氧化应激条件、抗癌药物刺激),wtp53过表达细胞较正常的HepG2细胞呈现促增殖、抗凋亡和抗药性,而mtp53过表达细胞则几乎无此现象,wtp53与肿瘤抗药性存在很强的相关性。3、荧光共聚焦结果表明wtp53细胞在氧化应激环境下,p53蛋白的亚细胞定位会发生从细胞核转向细胞质的变化,而mtp53因突变位点不同而有所差异。4、氧化刺激后,HepG2细胞中p53蛋白发生出核现象,仅磷酸化的p53(P-ser15)留在胞质中,而wtp53细胞磷酸化变化不显著,说明环境压力倾向于诱导wtp53脱磷酸化。5、p53蛋白与线粒体特异性标记Hsp60蛋白在氧化刺激后发生共定位,显示p53蛋白极有可能在应激环境下发生线粒体转位。6、琼脂糖凝胶电泳迁移率实验表明wtp53蛋白与mtND2存在相互作用。7、mtND2基因过表达会引起HepG2细胞凋亡程度增加,药敏性提高。线粒体中wtp53可抑制mtND2表达。8、正常情况下裸鼠体内wtp53过表达可抑制肿瘤增殖,但施加药物后wtp53过表达肿瘤表现出强增殖能力,Ki-67、PCNA、TGF-β等细胞因子表达量上升。结论:环境压力下wtp53蛋白过表达对肿瘤细胞有一定的保护作用,并且其抗药性等抗压力作用的发挥与p53蛋白的亚细胞定位密切相关。同时,细胞质中大量富集的wtp53蛋白可能通过与线粒体基因mtND2相结合,抑制mtND2的表达,从而阻碍线粒体凋亡路径的发生。