研究背景宫腔粘连(intrauterineadhesions,IUA)在 1894 年由 Fritsch 初次描述,在 1948年Asherman进行了详细报道,故又称Asherman综合征。IUA是指由于宫腔手术操作带来的创伤、宫腔感染、放射线等导致子宫内膜纤维化,造成子宫腔及宫颈管腔壁不同程度的闭塞。月经量减少、闭经、继发不孕或习惯性流产、慢性盆腔疼痛等是IUA常见的临床症状,也有一些病例无明显临床症状而仅在宫腔镜检查时发现。近年来IUA的发病率和检出率日益上升,成为育龄期妇女继发性不孕的重要病因。宫腔镜下宫腔粘连分离术可以在直视下松解宫腔粘连,恢复宫腔正常形态及容积,是目前临床上治疗IUA的标准术式。术后放置宫内节育器等物理屏障联合应用较大剂量雌激素则作为常规辅助治疗方案。尽管如此,IUA的整体复发率仍高达3.1%-23.5%,其中宫腔中、重度粘连占20%-62.5%,严重威胁着女性的生育功能及生殖健康。藉此,探索IUA的分子生物学机制,在疾病源头寻找有效抑制IUA发生的方法,越来越得到学者们的关注。IUA是子宫内膜损伤后修复障碍的结局,其本质是一种纤维化疾病。相对于正常子宫内膜13%-20%的纤维组织成分,IUA患者的活检标本中有50%-80%的纤维组织。子宫内膜过度纤维化和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积是多种细胞因子共同作用的结果,是IUA最重要的病理特征。因此,抑制子宫内膜损伤后修复过程中ECM的过度形成,可能有效阻断IUA进展。转化生长因子-β 1(Transforming growth factor-β 1,TGF-β1)与多种纤维化疾病相关,是目前所发现最重要的致纤维化因子,可以激活纤维细胞转化为肌成纤维细胞,对纤维化的形成具有重要启动作用。Smads蛋白是TGF-β1受体的激酶底物,其可将胞外信号由胞膜转至胞核进而调节转录。Smads家族中的Smad2/Smad3是TGF-β1信号下传的首个信号分子,其磷酸化在TGF-β生物学效应的发挥中起重要作用。TGF-β1/Smad信号通路活化后,可以上调其下游的结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的表达。CTGF 可协同 TGF-β1,发挥促纤维化作用,共同调控包括胶原蛋白在内的多种基质蛋白靶基因的转录,并参与介导ECM的合成和降解。此外,TGF-β1尚可诱导上皮细胞-间充质转化(eβithelial-mesenchymal transition,EMT),促进器官组织的纤维化进程。微小RNA(microRNA,miRNA)是新近发现的一类存在于多种生物体中的非编码小分子RNA,长度约21-25个核苷酸,通过其种子序列和mRNA 3’非编码区(3’UTRs)碱基配对,抑制mRNA翻译或促进mRNA降解。近年研究表明,microRNA-29(miR-29)家族与纤维化疾病紧密相关。在肾脏纤维化、肝硬化、特发性肺纤维化、心梗后心肌重塑、腹膜透析相关的腹膜纤维化、硬皮病等疾病中,相应器官组织的miR-29均有下调。动物实验也证实过表达miR-29在肝、心和肺等脏器中具有抗纤维化作用。除了靶向结合并降解胶原蛋白(COL1A1、COL1A2、COL3A1)和原纤维蛋白(FBN1)基因等纤维化相关基因外,miR-29还可对多条信号通路进行调控,在抗器官纤维化过程中发挥着举足轻重的作用。本课题组此前研究已发现,IUA患者子宫内膜组织中miR-29的水平显著降低,而子宫内膜组织中TGF-βl、Smad23的表达则显著升高并与宫腔粘连程度呈正相关,推测miR-29与TGF-β1/Smad信号通路之间可能存在复杂的相互调控机制,并共同参与了 IUA的发生发展过程。虽然miR-29b被证实参与了一些重要脏器纤维化的发生发展过程,但是关于miR-29b在IUA发病进程中发挥的作用及其机制尚未见相关报道。本课题在前期工作的基础上,分离培养了人原代子宫内膜基质细胞(Endometrial Stromal Cells,ESCs),以TGF-β1作用ESCs建立子宫内膜纤维化的细胞模型,继而将miR-29bmimics转染ESCs,研究其对纤维化的干预作用。此外,我们建立了 SD大鼠IUA动物模型,在体研究miR-29b对IUA的防治潜能,并探讨其作用机制,为临床探索新的IUA治疗方法提供理论依据。第一章TGF-β1诱导人原代子宫内膜基质细胞纤维化的机制研究目的:建立人原代子宫内膜基质细胞(Endometrial Stromal Cells,ESCs)分离、纯化、培养的方法。研究不同浓度的TGF-β1作用相同时间或同一浓度TGF-β1作用不同时间对细胞COL1A1、α-SMA、p-Smad2/3以及miR-29b表达的影响,并观察细胞形态的变化。探讨TGF-β1诱导ESCs发生纤维化的相关机制。方法:1.在无菌条件下收集符合条件的全层子宫内膜组织标本,采用胶原酶消化-筛网过滤的方法分离纯化ESCs,使用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养ESCs。待细胞生长融合达80%～90%时胰酶消化,按1:2或1:3传代培养。倒置显微镜观察细胞形态。2.选取第三代ESCs,进行细胞爬片培养。待盖玻片上的细胞融合达80%时以4%多聚甲醛固定,利用免疫细胞化学的方法检测细胞波型蛋白及角蛋白表达情况,进行细胞鉴定。3.以0、1、5或10ng/ml不同浓度TGF-β1作用于第3至第6代ESCs,采用实时定量RT-PCR检测细胞COL1A1、α-SMAmRNA以及miR-29b的表达,采用Western Blot技术检测COL1A1、α-SMA以及p-Smad2/3的蛋白表达水平。随后以10ng/ml浓度TGF-β1刺激ESCs,渐进延长细胞培养体系中TGF-β1作用时间,在12、24、48、72h后用同样的方法检测其对COL1A1、α-SMA与p-Smad2/3的基因和或蛋白水平的影响,以及ESCs中miR-29b的变化。4.将ESCs消化后,进行细胞爬片培养。用含有0、1、5或1Ong/ml不同浓度TGF-β1的培养液作用于ESCs。4d后将细胞固定、脱水、置换乙醇、干燥、喷金,随即使用扫描电镜观察细胞形态。结果:1.ESCs在接种24h后贴壁伸展,呈较短小梭形,均匀散在分布。6d～7d后,细胞数量增多,形态呈长梭形,细胞生长达80～90%融合时边界欠清,排布成漩涡状或辐射状。细胞传代后形态趋于一致,生长旺盛,呈纤维细胞样贴壁生长,传至第7代时依然能够保持良好生长状态。免疫细胞化学检测第3代ESCs胞质vimentin染色阳性,呈棕黄色,而Cytokeratin-18染色阴性,细胞不着色。分离纯化的ESCs纯度达98%以上。2.RT-PCR和western-blot结果显示,随着TGF-βl浓度增高,细胞COL1A1、α-SMA以及p-Smad2/3在mRNA和或蛋白水平表达量渐进性增加。3.RT-PCR和western-blot结果显示,随着TGF-β1作用时间的延长,细胞COL1A1、α-SMA以及p-Smad2/3在mRNA和或蛋白水平表达量渐进性增加。4.RT-PCR结果显示,随着TGF-β1作用浓度的增高及作用时间的延长,细胞miR-29b表达下降。与对照组相比,5ng/ml组(P<0.001)与10ng/ml组(P=0.006)miR-29b 的表达水平显著下调;48h 组(P=0.003)与 72h 组(P<0.001)miR-29b的表达水平也有显著下调。5.扫描电镜下观察,随着TGF-β1浓度梯度的升高,子宫内膜基质细胞形态渐变肥大,分泌细胞外基质增多;细胞伪足增多,而细胞间连接减少,活动性增强。其形态特征由纤维样细胞向肌成纤维样细胞形态过度、转变。结论:应用胶原酶消化-筛网过滤法可有效分离得到纯度较高、活性较好的ESCs。TGF-β1可以诱导ESCs发生肌成纤维细胞样形态改变,呈时间、浓度依赖性刺激细胞COL1A1、α-SMA及p-Smad2/3的表达增加,并使miR-29b表达下降。诱导ESCs向肌成纤维细胞转分化以及TGF-β1/Smad信号通路的活化是TGF-βl促使ESCs发生纤维化的两大重要机制。第二章过表达miR-29b在TGF-β1诱导的ESCs纤维化中的作用机制研究目的:在TGF-βl作用前后分别转染miR-29b mimics,检测其对ESCs中COL1A1、α-SMA、p-Smad2/3以及miR-29b表达的影响,并检测其对细胞增殖、凋亡以及细胞周期的影响,体外研究过表达miR-29b对TGF-βl刺激ESCs发生纤维化的干预作用并探讨内在的分子机制。方法:1.实验分组:共分6组,实验独立重复3次。(1)正常对照组:ESCs,不加干预措施。(2)模型对照组(TGF-βl 组):10 ng/ml TGF-β1 作用 ESCs。(3)预防 miR-29b 组:先转染 50nM miR-29b,再加 10ng/ml TGF-β1 作用ESCs。(4)预防 miR-NC 组:先转染 50Nm miR-NC,再加 10ng/ml TGF-β1 作用ESCs。(5)治疗miR-29b组:先以1Ong/mlTGF-β1刺激诱导纤维化,再转染50nM miR-29b。(6)治疗miR-NC组:先以10ng/ml TGF-β1刺激诱导纤维化,再转染50 nM miR-NC。2.细胞转染:转染前一天调整细胞接种密度,使转染时ESCs达约50%融合。转染前将Opti-MEM:mimics储存液体积比为50:1.25的混合液a以及Opti-MEM:lipo2000体积比为50:1的混合液b轻轻混匀成mimic-lipo2000混合液。20min后将其加入含适量Opti-MEM培养基的细胞培养皿中,使mimics的终浓度为50nM。转染6h后将培养基全部吸净移除,按实验设计更换培养基。3.采用实时定量RT-PCR检测观察终点各组细胞miR-29b表达水平以及COL1A1、α-SMA mRNA 的表达量。4.采用Western Blot以及细胞免疫荧光技术检测观察终点各组细胞COL1A1、α-SMA以及p-Smad2/3蛋白表达情况。5.细胞增殖率使用CCK-8试剂盒检测,首先进行细胞计数,使96孔板每孔含有3000个细胞。在各组处理的终点,每孔加入10μl CCK-8溶液,37℃继续孵育2h,在450nm波长处检测各孔吸光度值。6.采用流式细胞技术检测各组ESCs的细胞凋亡及细胞周期。结果:1.转染miR-29b mimics后,各组间miR-29b的表达量差异显著(F=175.630,P<0.001)。miR-29b 预防组(P=0.006)及 miR-29b 治疗组(P=0.015)的 miR-29 b表达量均明显上调,实现在ESCs过表达miR-29b。2.各组间 COL1A1(F=45.551,P<0.001)及 α-SMA(F=28.688,P<0.001)的mRNA表达量均有显著差异;MEG3的表达水平在各组间也存在显著差异(F=34.220,P<0.001)。miR-29b 预防组及 miR-29b 治疗组的 COL1A1、α-SMA的mRNA表达量较均TGF-β1组明显下调,MEG3表达水平较均TGF-β1组明显上调。其中miR-29b预防组的α-SMA及MEG3变化更为显著。3.三种蛋白的表达量在各组间均有显著差异:COL1A1(F=86.104,P<0.001)、α-SMA(F=139.874,P<0.001)以及 p-Smad2/3(F=86.451,P<0.001)。miR-29b预防组及miR-29b治疗组的COL1A1、α-SMA以及p-Smad2/3的蛋白表达量较TGF-β1组均有明显下调。其中miR-29b预防组下调幅度更为显著。细胞免疫荧光结果还显示,转染miR-29b的预防组和治疗组中p-Smad2/3细胞核内转位及核内积聚的现象减少。4.CCK8检测结果显示,各组间细胞增值率差异显著(F=456.240,P<0.001)。与TGF-β1组相比,miR-29b预防组及miR-29b治疗组的细胞增值率均有显著下降,其增值率分别为58.35±0.13%及68.00±1.81%。5.流式细胞结果显示,各组间细胞凋亡率差异显著(F=34.317,P<0.001)。与TGF-β1组相比,miR-29b预防组及miR-29治疗组的细胞凋亡率增加,分别为 14.39±0.52%及 13.83±0.96%。过表达 miR-29b 诱使 ESCs 在 G0/G1 期阻滞。结论:转染miR-29b mimics能够在mRNA及蛋白水平抑制TGF-β1对ESCs中COL1A1、α-SMA表达的上调作用,并抑制p-Smad2/3蛋白表达及核内转位。此外,过表达miR-29b mimics还能上调ESCs的MEG3表达,并促使转分化的细胞增殖减少、凋亡增加,诱使细胞周期阻滞在G0/G1期。miR-29b可能是子宫内膜纤维化的潜在靶向治疗剂。第三章成年SD大鼠宫腔粘连动物模型的建立目的:评价以刮宫及宫内留置脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)手术线的双重损伤法建立的SD大鼠IUA动物模型,研究建模后不同时间点子宫内膜组织的病理演变过程,为后续研究提供动物模型基础及干预方案参考。方法:1.选用雌性未生育过的SD大鼠,质量250g～280g。建模前24h将无菌10号手术线浸泡于lOmg/LLPS溶液,4℃保存。2.实验分组:大鼠随机分为3组,(双重损伤法)模型组20只;假手术对照组20只;正常对照组(造模前)5只。在造模后48h(2d)、一个动情周期(4d)、两个动情周期(9d)及四个动情周期(18d)分别处死(双重损伤法)模型组与假手术对照组各5只。3.每日清晨对大鼠进行阴道涂片检查。美兰染色后显微镜下判断大鼠动情周期。4.建模方法:大鼠麻醉后取下腹正中切口进腹,暴露子宫,在子宫分叉以上做长约3mm纵行切口,用刮勺搔刮切口以上的子宫腔,刮宫完成后,宫腔留置LPS手术线,子宫还纳腹腔后关腹,腹壁留LPS手术线尾丝约1cm,48h后经腹壁抽出。5.在各观察终点处死大鼠,收集子宫标本,多聚甲醛固定后制石蜡切片,分别行HE染色及Masson染色。显微镜下观察子宫内膜形态改变,并在高倍镜视野下计数子宫内膜腺体;利用IPP图像分析软件计算每高倍镜视野子宫内膜间质胶原面积比率。结果:1.建模48h,镜下见子宫内膜上皮完全脱落,腺体消失。内膜间质可见出血,组织水肿严重,大量白细胞浸润,内膜裸露区有大量纤维素样渗出及少量凝固性坏死,固有胶原崩解液化,未见明显胶原沉积。建模4d,镜下仅见极少量扁平上皮细胞覆盖未粘连区域,无腺体再生。间质出血、水肿减轻,淋巴细胞浸润,腔内坏死组织机化成息肉样宫腔粘连带,纤维组织增生,胶原纤维含量有所增加。建模9d,镜下见部分宫腔横断面完全闭锁,未完全闭锁节段可见牢固粘连带。内膜间质极少腺体可见,大部分间质区细胞稀少,纤维组织增生,可见粗大胶原纤维聚集,罕见间质毛细血管。建模后18d,宫腔改变和建模后9d类似,子宫内膜形态学未恢复或好转,宫腔瘢痕化修复。2.造模前及造模后不同时间点各组大鼠子宫间质胶原纤维面积比率有显著差异(F=197.526,P<0.001)。与正常组(20.49±3.56%)相比,术后 4d(42.11±3.57%)、9d(65.32±7.98%)及 18d(67.82±5.77%)组的胶原纤维比率增加显著,而术后48h组(22.64±2.52)无显变化。与术后4d组相比,术后9d及18d组的胶原纤维比率也有显著增加,但术后9d组及18d组之间则无显著差异。3.造模前及造模后不同时间点各组大鼠子宫腺体计数有显著差异(F=104.983,P<0.001)。与正常组相比(9.7±0.95),术后 48h(1.9±1.20)、4d(2.30±1.34)、9d(1.90±1.10)及 18d(1.50±0.71)组的腺体计数均显著下降,而在术后48h、4d、9d及18d组间则无明显变化。提示双重损伤法造模后随时间延长,腺体未能再生。4.双重损伤法的成模评估:在造模术后48h时仅造成子宫内膜的损伤,胶原面积比率未见显著差异(P=0.108);与假手术组对比,术后4d(P<0.001)、9d(P<0.001)及18d(P<0.001)时子宫内膜胶原面积比率有显著升高,IUA模型在术后4d初成,且模型至少稳定至术后18d。结论:大鼠子宫内膜在刮宫及宫内留置LPS手术线的双重损伤下发生了不可逆的损伤及纤维化,运用此法可成功建立稳定的大鼠IUA模型。该模型的子宫内膜在造模48h内以急性炎症为主,造模第4天有一定程度的ECM聚集,随着纤维化进程发展,造模第9天纤维化程度到达高峰并持续到第18天,子宫内膜最终瘢痕修复。第四章Agomir-29b对SD大鼠宫腔粘连防治作用的研究目的:在上一章建立IUA大鼠模型的基础上,在体转染rno-miR-29b agomir(agomir-29b),研究agomir-29b对IUA的防治潜能,并探讨其作用机制。为临床探索新的IUA防治方法提供理论依据。方法:1.将35只SD大鼠随机分为7组,每组5只大鼠。分别为:①假手术对照组;②模型4d组;③模型9d组;④agomir-阴性对照预防组;⑤agomir-29b预防组;⑥agomir-阴性对照治疗组;⑦agomir-29b治疗组。2.动物麻醉及建模方法同第三章,给药方法:开腹暴露子宫,在直视下采用子宫肌壁间多点局部注射的方式给药。3.收集子宫组织,每侧子宫角截为4段:(1)投入4%多聚甲醛固定液用于石蜡包埋,制作石蜡切片进行HEMassom染色,观察子宫内膜形态、进行腺体计数并计算子宫内膜间质胶原面积比率;免疫组化检测TGF-βl及COL1A1的表达;组织免疫荧光观察a-SMA及p-Smad2/3 的表达。(2)投入TRIzol提取RNA,使用实时定量PCR检测miR-29b、COL1A1、α-SMA以及E-cadherin的表达。(3)置-80℃,用于蛋白提取,Western Blot技术检测COL1A1、α-SMA、E-cadherin、CTGF、p-Smad2/3 以及 Sp1 的蛋白表达量。(4)剩余部分放置液氮罐备用。结果:1.对各组的miR-29b相对表达量进行方差分析,不同处理组间差异显著(F=403.223,P<0.001)。与假术组相比,模型4d组(0.36±0.05)与模型9d组(0.23±0.06)的miR-29b相对表达量显著下降,但二者之间无显著差异。与模型 9d 组比,体内转染 agomir-29b 后,agomir-29b 预防组(1.66±0.16)与 agomir-29b治疗组(1.60±0.10)的miR-29b相对表达量均显著升高,两者间无显著差异。但是,体内转染agomir-negative control的agomir-阴性对照预防组及agomir-阴性对照治疗组的miR-29b表达量则无显著变化。提示:在双重损伤法建立的IUA大鼠模型中,miR-29b表达水平降低。而子宫肌壁间多点注射的方法能够有效体内转染miR-29b,使得miR-29b在IUA模型子宫组织中过表达。2.石蜡切片HE及Masson染色镜下观察:agomir-29b预防组及agomir-29b治疗组可见子宫内膜间质中有不同程度的腺体再生,散在均匀分布,子宫腔大小不一,呈椭圆形或不规则形态,表面覆盖单层立方或柱状上皮;Masson染色可见间质胶原纤维不同程度的减少。不同处理组间子宫内膜胶原面积比率(F=134.748,P<0.001)及腺体计数(F=87.250,P<0.001)均有显著性差异。与模型 9d 组(63.56±5.88%)相比,agomir-29b 预防组(25.21±2.00%)及 agomir-29b治疗组(43.57±5.58%)的子宫内膜胶原面积比率显著下降。然而agomir-29b治疗组与模型4d组(41.57±4.27%)的相比,子宫内膜胶原面积比率无统计学差异;此外,与模型9d组(1.80±1.03个)相比,agomir-29b预防组(8.00±1.83个)及agomir-29b治疗组(4.60±0.84个)的腺体计数显著上升。3.不同处理组间COL1A1 mRNA相对表达量(F=43.620,P<0.001)及蛋白相对表达量(F=820.970,P<0.001)均有显著性差异。与假手术对照组子宫COL1A1 mRNA及蛋白相对表达量相比,模型4d组与模型9d组子宫COL1A1 mRNA及蛋白相对表达量显著上升,且模型9d组高于模型4d组,差异有统计学意义。与模型9d组比,agomir-阴性对照预防组与agomir-阴性对照治疗组的子宫COL1A1 mRNA及蛋白相对表达量均无显著差异;agomir-29b预防组及agomir-29b治疗组的COL1A1 mRNA及蛋白相对表达量则显著下降,其中agomir-29b预防组下降至假手术对照组水平,而agomir-29b治疗组与模型4d组相比差异无统计学意义。COL1A1免疫组化结果显示不同处理组间MOD值有显著性差异(F=319.170,P<0.001),并与Western Blot检测的蛋白相对表达量的变化一致。4.不同处理组间α-SMA mRNA相对表达量(F=526.036,P<0.001)及蛋白相对表达量(F=268.308,P<0.001)均有显著性差异。与假手术对照组相比,模型4d组mRNA及蛋白相对表达量上调,差异有统计学意义;模型9d组子宫α-SMA mRNA及蛋白相对表达量也显著上升。与模型9d组比,agomir-阴性对照预防组与agomir-阴性对照治疗组的子宫α-SMA mRNA及蛋白相对表达量无显著差异;agomir-29b预防组及agomir-29b治疗组的α-SMA mRNA及蛋白相对表达量则显著下降,其中agomir-29b预防组下降至假手术对照组水平,而agomir-29b治疗组mRNA及蛋白相对表达量与模型4d组相比差异无统计学意义。α-SMA免疫荧光结果显示与WB检测的蛋白相对表达量的变化一致。5.在不同处理组间E-Cadherin mRNA相对表达量(F=286.418,P<0.001)及蛋白相对表达量(F=239.158,P<0.001)均有显著性差异。与假手术对照组相比,模型4d组与模型9d组子宫E-Cadherin mRNA及蛋白相对表达量显著下降;且模型9d组的mRNA及蛋白相对表达量显著低于模型4d组,差异有统计学意义。与模型9d组比,agomir-阴性对照预防组与agomir-阴性对照治疗组的E-Cadherin mRNA及蛋白相对表达量无显著差异;agomir-29b预防组及agomir-29b治疗组的E-Cadherin mRNA及蛋白相对表达量则显著升高,差异有统计学意义。6.子宫内膜TGF-β1蛋白免疫组化MOD值在不同处理组间有显著性差异(F=782.731,P<0.001)。与假手术对照组(0.005±0.002)相比,模型4d组与模型9d组子宫TGF-β1蛋白表达量显著上升,且模型9d组(0.111±0.011)高于模型4d组(0.0422 ±0.008),差异有统计学意义。与模型9d组比,agomir-阴性对照预防组(0.109±0.008)与agomir-阴性对照治疗组(0.116±0.007)的子宫内膜TGF-β1蛋白表达量无显著差异;agomir-29b预防组(0.005 ±0.001)及agomir-29b治疗组(0.050 ±0.007)的TGF-β1蛋白表达量则显著下降,其中agomir-29b预防组下降至假手术对照组水平,而agomir-29b治疗组TGF-β1蛋白表达量与模型4d组相比差异无统计学意义。7.Western Blot 检测各组间 p-Smad2/3(F=410.103,P<0.001)、CTGF(F=110.733,P<0.001)以及 Spl(F=167.661,P<0.00l)的蛋白相对表达量均有显著差异。与假手术对照组相比,模型4d组与模型9d组子宫p-Smad2/3、CTGF以及Spl蛋白相对表达量均明显上升,且模型9d组均高于模型4d组,差异有统计学意义。与模型9d组比,agomir-阴性对照预防组与agomir-阴性对照治疗组的子宫p-Smad2/3、CTGF以及Spl蛋白相对表达量均无明显差异;agomir-29b预防组及agomir-29b治疗组的p-Smad2/3、CTGF以及Spl蛋白相对表达量则都有明显下降。其中agomir-29b预防组p-Smad2/3、CTGF以及Spl蛋白相对表达量均下降至假手术对照组水平,而agomir-29b治疗组p-Smad2/3、CTGF以及Spl蛋白相对表达量与模型4d组水平相当。p-Smad2/3免疫荧光结果与Western Blot检测的蛋白相对表达量的变化一致。并且我们看到,随着agomir-29b预防组及agomir-29b治疗组的p-Smad2/3蛋白相对表达量的下降,p-Smad2/3的细胞核转位被抑制、核内聚集也减少。结论:在大鼠IUA成模过程中,子宫内膜胶原面积比率上升、腺体未能再生、ECM不断积聚,并伴随TGF-β1/Smad信号通路被活化,以及EMT现象。造模同时预防性转染agomir-29b可有效抑制子宫内膜纤维化,使得子宫内膜得以修复,胶原生成减少、腺体数量恢复。造模第4天首次治疗性转染agomir-29b虽不能有效逆转已经形成的纤维化组织,但能够阻滞IUA进程,可在一定程度上减轻子宫内膜纤维化程度,抑制胶原生成、促进腺体再生。miR-29b通过抑制TGF-βSmad-CTGF-Sp1轴、阻止EMT的机制发挥抗子宫内膜纤维化作用。