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猪流行性腹泻近年来的频繁爆发及哺乳仔猪的高致死率不仅为猪养殖产业带来巨大经济损失,同时也说明依赖主动免疫发挥作用的传统疫苗(灭活疫苗、活疫苗等)对哺乳仔猪并无明显效果,因此采用基因工程手段研制新型疫苗对猪流行性腹泻的治疗有积极意义。7-14日龄及以下仔猪免疫系统的不完善证明仔猪被动免疫的迫切性,因此本研究利用基因工程手段制备并检测可用于口服的抗体。本研究在实验室已有抗PEDV COE蛋白单链抗体sc Fv基因的基础上,将单链抗体sc Fv序列在进行大肠杆菌原核表达优化的同时在序列翻译5’端加入一段纤维素结合结构域(cellμLose binding domain,CBD)序列,然后构建原核表达载体p ET19B-CBD-sc Fv。并对BL21/p ET19BCBD-sc Fv的摇菌条件进行优化,研究了温度、IPTG诱导剂量、诱导时间长度等因素对菌体生长和蛋白表达量的影响。采用硫酸水解法制备纳米纤维素,50g纤维素纸加入500m L 64%的硫酸中,45℃水浴1h,反应产物加入2.5L去离子水终止反应后离心、透析、超声后采用热干燥法测所得纳米纤维素浓度;将复性后CBD-sc Fv蛋白与纳米纤维素结合并从纤维素浓度、结合时间、结合温度等条件优化结合条件。将实验室保存PEDV疫苗毒以10%接种于传至3代的vero细胞上,72h收集细胞液冻融3次后离心过滤收集上清分装保存于-80冰箱。Reed-Muench法测定培养PEDV病毒TCID50,以此病毒和复性后sc Fv蛋白为样品进行病毒中和试验,不同稀释度PEDV和CBD-sc Fv加入96孔板中观察每孔细胞形态变化。试验结果显示原核表达菌种BL/p ET19B-CBD-sc Fv最佳条件为菌体在37℃,IPTG诱导浓度为0.6m M,诱导时间为7h,以最佳诱导条件诱导的蛋白含量最高可达0.952mg/m L。硫酸水解法制备的纳米纤维素经热干燥法测得浓度为4.02mg/m L,动态光散射法检测到纳米纤维素粒子流体动力学平均半径为229.8nm。纳米纤维素与蛋白sc Fv结合条件为在室温(25℃),反应4h时结合量达到最佳值。Vero细胞培养PEDV后采用RT-PCR检测细胞培养液中的PEDV,并采用Reed-Muench法测定病毒TCID50=10-1.32/100微升;病毒与抗体蛋白中和试验最终结果显示每孔细胞形态变化未到达理想状态,还需要进一步的细胞试验优化及下一步的动物试验验证PEDV与单链抗体的中和作用。综上所述,密码子优化后单链抗体可在原核表达系统中高效表达;同时单链抗体可与制备的纳米纤维素有效结合,并成功制备可在室温条件下保存的单链抗体与纳米纤维素复合物;经RT-PCR法鉴定PEDV在vero细胞中成功培养;病毒与单链抗体的中和试验结果虽然失败,但是下一步试验可继续在病毒滴度及其与单链抗体的浓度比例上继续优化。本试验在单链抗体高效表达制备后为抗体蛋白的稳定保存,及其在抗PEDV被动疫苗免疫的研究奠定一定的研究基础,为PEDV防治提供了一种新型手段。