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缺氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的重要病理生理改变,其发病率和死亡率高,对其复杂病因、发病的分子生物学机制尚未完全阐明,临床缺乏理想的治疗药物;目前已成为社会公共卫生和临床的突出问题。研究认为肺血管重构是发生缺氧性肺动脉高压最重要的病理生理基础,其本质变化是肺动脉阻力血管中膜平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)异常增殖/凋亡抑制,与肺动脉平滑肌细胞KATP通道功能密切相关:在缺氧性肺动脉高压发生时肺动脉平滑肌细胞KATP通道表达下调、功能下降。本实验室前期研究发现,我国学者自行研制的新型KATP通道开放剂Iptakalim能激活大鼠、兔肺动脉平滑肌细胞KATP通道,增加细胞KATP通道mRNA表达,呈浓度依赖性增加大鼠肺动脉SMCs的外向性钾电流,抑制ET-1诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞内游离Ca2+增加,拮抗ET-1诱导的细胞增殖;能通过血脑屏障作用于大脑皮层神经元KATP通道,保护脑神经元,免受缺氧性损伤,治疗慢性缺氧性肺动脉高压时的主要并发症——缺氧性脑病;本实验室还发现Iptakalim能有效拮抗ET-1诱导的人肺动脉平滑肌细胞内游离Ca2+增加,抑制细胞由G0期向G1期和M期的转化,选择性地抑制肺血管痉挛和重构,而对正常体循环压和正常肺动脉压无明显影响。基于Iptakalim抑制肺动脉平滑肌细胞异常增殖、抑制肺血管重构的重要药理学作用和潜在的临床应用前景,探索Iptakalim抑制肺动脉平滑肌细胞异常增殖的调控途径,对阐明肺动脉高压发病的分子机制、进一步指导临床治疗具有重要的理论和现实意义。蛋白质是生物体执行各种复杂生理功能的主体,蛋白质组学(proteomics)为系统探讨肺动脉平滑肌增殖/凋亡失衡的分子机制提供了良好的研究平台。本研究在前期实验的基础上,建立人肺动脉阻力血管平滑肌细胞模型,运用蛋白质组学研究常用的技术手段——双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)和质谱(mass spectrometry, MS)分析Iptakalim抑制人肺动脉阻力血管平滑肌细胞增殖(ET-1诱导)时蛋白质表达谱的变化,筛选与Iptakalim调控细胞增殖相关的蛋白分子,从蛋白水平分析Iptakalim抑制平滑肌细胞异常增殖可能的分子途径。本研究通过组织贴块法建立人肺动脉阻力血管平滑肌细胞株,并通过差异贴壁法纯化细胞,用细胞免疫化学方法鉴定平滑肌细胞纯度达99%以上;然后应用蛋白质组学研究常用的实验手段(双向凝胶电泳、质谱和生物信息学)比较了正常、ET-1诱导增殖和KATP通道开放剂Iptakalim抑制ET-1诱导增殖后人PASMCs细胞表达谱的变化,用质谱分析了差异在5倍以上的蛋白质分子。结果提示,Iptakalim抑制ET-1诱导的细胞增殖后,多种蛋白分子表达发生变化,主要包括:细胞骨架相关蛋白(actin, Vimentin, Lamin A/C, Tubulin)、质膜蛋白及受体样蛋白(annexin A5, G protein subunit beta 1, nucleoporin P54, Transmembrane channel-like protein 5)、伴侣蛋白分子(Hsp60, GRP 78, T-complex protein)、离子转运相关蛋白(Transmembrane channel-like protein 5,Lasp-1)和代谢相关蛋白(Purine nucleoside phosphorylase, PGAM1 protein, Pgk1, et al)。本研究用定量PCR方法和Western blot方法验证了Hsp60、Vimentin和NUP54在各实验组的表达,结果与2-DE MS数据相符合;本研究还分析了Bcl-XL在各实验组中的表达,结果显示Iptakalim也能调控Bcl-XL表达。本研究还筛选出干涉NUP54的siRNA有效片段,并初步建立了稳定的RNA干涉的实验技术平台,为下游蛋白质功能验证和相关性分析建立了研究基础。本实验结果对阐明缺氧性肺动脉高压发病的分子机理、进一步筛选有效的治疗靶标提供了研究基础。