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研究背景消化道恶性肿瘤中，胃癌居首位。近年来，胃癌的发病率与死亡率均呈上升趋势，由于早期胃癌的临床症状不明显，发现率低，所以临床进行治疗的胃癌，大多为中晚期胃癌，仅依赖手术治疗，达不到预期的治疗效果，化疗便成为中晚期胃癌及术后胃癌的主要治疗方法之一。但近来由于胃癌多药耐药（multidrug resistance，MDR）的产生，致使肿瘤的化疗效率降低。胃癌MDR是由于多种因素的共同作用，使肿瘤细胞对化疗药物失去疗效，最终导致化疗失败。因此，深入研究胃癌MDR形成的机制，寻找克服MDR的方法，可能会引起肿瘤化疗的新突破。随着蛋白质组学的诞生，和近年来蛋白质组计划的实施，肿瘤MDR的研究也因此而有了新的思维方式，并为其开创了新的研究领域，并可从组织或细胞的整体蛋白水平，对肿瘤的MDR机制进行研究，可能使其发生新的突破。本课题组曾从蛋白质水平研究胃癌细胞的MDR，以胃癌细胞SGC7901、胃癌阿霉素耐药株SGC7901/ADR及经丹参逆转后的SGC7901/ADR为对象，应用蛋白质组学技术，对这三种细胞进行了差异蛋白质组学研究，并应用HPLC-ESI-MS/MS方法进行质谱分析，结果发现，胃癌SGC7901细胞中S100A6呈高表达，而其阿霉素耐药株SGC7901/ADR中S100A6的表达下调，呈不表达或低表达现象；SGC7901/ADR的多药耐药性经丹参逆转后，细胞中S100A6再次呈现高表达。为验证以上研究结果，后又运用细胞免疫化学方法、Western-blot分析，检测胃癌细胞SGC7901，阿霉素耐药株SGC7901/ADR中S100A6的蛋白表达水平，结果，细胞免疫化学与Western-blot分析结果均显示，胃癌SGC7901细胞中S100A6高表达，而阿霉素耐药株SGC7901/ADR中S100A6的表达明显降低，提示S100A6表达下降可能与胃癌MDR相关，然而，运用RT-PCR技术对S100A6在这两种细胞中的mRNA表达水平进行检测发现：在mRNA表达水平上，胃癌细胞株SGC7901及其阿霉素耐药株SGC7901/ADR中S100A6的表达无差异，为了进一步验证S100A6低表达与MDR的关系，及解释S100A6在这两种细胞中出现的mRNA表达水平与蛋白表达水平不一致的现象，本实验运用真核细胞质粒转染技术将载有S100A6基因的质粒导入SGC7901/ADR细胞中，应用免疫细胞化学方法和RT-PCR技术，分别对未行质粒转染操作的SGC7901/ADR细胞和转染载有S100A6基因的质粒后的SGC7901/ADR细胞中S100A6的表达水平进行检测，观察转染前后SGC7901/ADR细胞中S100A6在mRNA与蛋白水平的表达情况，探讨SGC7901/ADR细胞中S100A6蛋白表达下调的机制，为深入研究肿瘤MDR机制奠定基础。研究目的进一步验证S100A6低表达与MDR的关系，解释胃癌细胞株SGC7901及胃癌阿霉素耐药株SGC7901/ADR中出现的S100A6在mRNA表达水平与蛋白表达水平不一致的现象，检测S100A6分别在转染前后的SGC7901/ADR中的表达，进一步探讨S100A6在SGC7901/ADR细胞中表达下调的机制。试验方法将购买的载有S100A6基因的质粒pCMV6-ENTRY转化进已制备好的DH5α感受态大肠杆菌，用E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I质粒提取试剂盒提取质粒，并应用PCR技术和基因测序技术对所提质粒进行鉴定。培养人胃癌阿霉素耐药细胞株SGC7901/ADR细胞，应用质粒转染技术，将载有S100A6基因的质粒导入SGC7901/ADR细胞中。用RNA提取试剂提取未转染和转染后两种细胞的总RNA，运用半定量RT-PCR技术检测S100A6在两种细胞中mRNA水平上的表达情况。应用细胞爬片技术，分别将传代培养的SGC7901/ADR和质粒转染后的SGC7901/ADR细胞种植于6孔板中预处理过的盖玻片上，正常培养24小时后，应用MaxVisionT M快捷免疫组化（二步法）观察S100A6在两种细胞中蛋白水平上的表达情况。从而分析SGC7901/ADR细胞中S100A6蛋白表达下调的可能原因。实验结果所提质粒经PCR技术和基因测序技术鉴定后确定含有S100A6基因序列。半定量RT-PCR结果：分别提取未转染和转染后两种细胞的总RNA，进行半定量RT-PCR，将扩增产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，将未进行转染的SGC7901/ADR细胞的S100A6基因条带信号强度和转染有目的基因的SGC7901/ADR细胞的S100A6基因条带信号强度进行比较，发现后者比前者信号更强，重复四次操作，用凝胶成像分析软件Gel-pro analyzer测定电泳条带强度，未进行转染操作的细胞中S100A6mRNA IOD x：1.92e5，质粒转染48h后细胞中S100A6mRNA IOD x：3.07e5，以GAPDH为内标基因，测得未进行S100A6基因转染的SGC7901/ADR细胞中S100A6mRNA的平均表达量为0.426±0.027，而转染含有S100A6基因的质粒后的SGC7901/ADR细胞中S100A6mRNA的平均表达量为0.530±0.007，作两独立样本的t检验，经统计学分析，差异具有显著性（P＜0.05）。未转染含有S100A6基因质粒的SGC7901/ADR细胞中S100A6胞浆染色为阳性（++），胞浆染成棕黄色。而当向SGC7901/ADR细胞中导入含有目的基因的质粒后，S100A6的表达量无明显升高，染色亦为阳性（++），胞浆染成棕黄色。结论1、转染进SGC7901/ADR细胞中的质粒能使S100A6基因扩增，S100A6mRNA在转染载有S100A6基因的质粒后SGC7901/ADR细胞中的转录水平明显高于未行转染操作的SGC7901/ADR细胞中的转录水平。2、S100A6蛋白在未行转染操作的SGC7901/ADR细胞中的表达与转染载有S100A6基因的质粒后SGC7901/ADR细胞中的表达无明显差异；3、S100A6在mRNA转录水平的升高与蛋白表达水平不升高的现象，可能与蛋白质降解机制有关。