胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，在全世界范围内，胃癌在恶性肿瘤导致的死亡中位居第二位。胃癌发病率各国不一。我国每年约有17万人死于胃癌，几乎接近全部恶性肿瘤死亡人数的1/4。由于早期缺乏特异的临床症状，临床诊治的病例绝大多数为中晚期，预后较差。Klotho基因是近期发现的一个新的抗癌基因。早期的研究认为Klotho基因与衰老密切相关。早期动物实验发现Klotho基因缺陷型小鼠会出现一系列类似人类衰老的表型，而过表达则能够延长小鼠的寿命，并发现Klotho基因通过抑制胰岛素信号通路抗衰老。近年来研究显示:Klotho基因与多种肿瘤密切相关，作为抑癌基因而失活，从而导致肿瘤的发生发展。虽有文献报道Klotho可能作为抑癌基因在胃癌中丢失，但Klotho在胃癌中表达改变的实际意义及其生物学功能目前仍不明确。本文拟展开Klotho在胃癌细胞株中的实验研究，由于Klotho基因通过抑制胰岛素信号轴抑制衰老和延长寿命，我们提出Klotho在胃癌中是否作为一种肿瘤抑制因子而存在?是否是通过抑制胰岛素信号轴抑制胃癌的生长、增值、促进胃癌细胞凋亡和自噬。因此，我们设计实验研究如下:　　1.研究Klotho基因及蛋白在人胃癌细胞株MNK-45、AGS、GC-7901及人胃粘膜细胞株GES-1中的表达特点，分析Klotho基因及蛋白低表达的原因，研究Klotho基因的表达是否受表观遗传学的调控，是否与Klotho基因启动子区甲基化密切相关。　　2.给予不同浓度的去甲基化酶5-AZa干预胃癌细胞株GC-7901，检测不同浓度的5-AZa恢复胃癌细胞株GC-7901 Klotho基因的表达是否呈现计量依赖性，并选择最佳浓度作为进一步研究，检测Klotho基因恢复后对胃癌细胞凋亡、自噬及胰岛素相关信号通路轴的研究。　　3.构建Klotho的真核表达载体，并瞬时转染胃癌细胞株GC-7901，构建高表达Klotho基因的胃癌细胞株GC-7901，为进一步研究做准备。　　4.研究高表达Klotho基因对胃癌细胞株GC-7901的增殖、凋亡、细胞周期、自噬及胰岛素相关信号通路的作用。　　第一章Klotho基因及蛋白在胃癌细胞株中的表达　　目的:　　研究Klotho基因及蛋白在胃癌细胞株MNK-45、AGS、GC-7901和人胃粘膜细胞GES-1中的表达特点。分析Klotho基因缺失的原因。　　方法:　　抽提以上四种细胞总RNA，采用PCR技术检测Klotho基因在胃癌细胞株MNK-45、AGS、GC-7901和人胃粘膜细胞GES-1中的表达，免疫印记检测Klotho蛋白在各组细胞株中的表达水平，甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR，MS-PCR)检测以上四种细胞株Klotho基因启动子区甲基化程度，并分析其表达特点。　　结果:　　人胃粘膜细胞GES-1中Klotho基因及蛋白的表达显著高于胃癌细胞系MNK-45、AGS和GC-7901，经统计学分析，具有显著的统计学意义(P＜0.001)，而GC-7901Klotho基因及蛋白表达最低。经甲基化PCR检测发现胃癌细胞株MNK-45和AGS Klotho基因启动子区部分甲基化，胃癌细胞株GC-7901 Klotho基因启动子区完全甲基化，而人胃粘膜细胞GES-1 Klotho基因启动子区未见甲基化表达。　　结论:　　1.Klotho基因及蛋白在胃癌细胞株MNK-45、AGS和GC-7901中的表达明显低于人胃粘膜细胞GES-1中的表达，在胃癌细胞株GC-7901中的表达最低。　　2.Klotho基因低表达与启动子区甲基化密切相关，GC-7901胃癌细胞株中Klotho基因启动子区完全甲基化。　　第二章5-Aza诱导胃癌细胞株GC-7901Klotho基因的表达及生物学意义　　目的:　　给予不同浓度的5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine，5-Aza)干预胃癌细胞株GC-7901，检测不同浓度的5-Aza恢复胃癌细胞株GC-7901 Klotho基因的表达是否呈现计量依赖性，并选择最佳浓度作为进一步研究，研究5-Aza干预胃癌细胞株GC-7901后Klotho基因及蛋白的表达情况，并检测Klotho基因的恢复对胃癌细胞株GC-7901凋亡、自噬及胰岛素相关信号通路轴的影响。　　方法:　　选择不同浓度的5-Aza5-μmol/L、10μmol/L、20μmol/L干预胃癌细胞株GC-7901，72小时后用western blot检测Klotho蛋白及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ的表达。选择5-Aza最佳浓度10μmol/L干预GC-7901，并应用自噬抑制剂3-MA提前干预，实验分三组:空白对照组、5-AZa组、3-MA+5-Aza组，流式细胞仪检测三组细胞的凋亡，western blot检测三组细胞中Klotho蛋白的表达和胰岛素信号通路轴相关蛋白IGF-1R及下游信号通路相关蛋白PI3K和mTOR的表达。Western blot检测p-IGF-1R及下游信号通路相关蛋白p-PI3K和p-mTOR的表达。免疫印记及共聚焦实验检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ的表达。　　结果:　　1.不同浓度的5-Aza均可恢复胃癌细胞株GC-7901Klotho基因的表达，增加胃癌细胞的自噬，并呈计量依赖性，但10μmol/L5-Aza干预后胃癌细胞的状态最佳。　　2.10μmol/L5-Aza恢复GC-7901Klotho基因的表达后，可诱导胃癌细胞株GC-7901细胞自噬及凋亡增加。5-Aza组中细胞凋亡及自噬明显增加，与空白对照组相比具有统计学意义(P＜0.05)，3-MA可以抑制5-Aza组的自噬及凋亡，但不能完全抑制。　　3.10μmol/L5-Aza恢复GC-7901Klotho基因的表达，可抑制胰岛素相关信号通路轴中相关蛋白的磷酸化表达，p-IGF-1R、p-PI3K、p-mTOR的表达明显减少，空白对照组与5-Aza组经统计学分析具有统计学意义(P＜0.05)。但对总蛋白IGF-1R、PI3K、mTOR无影响。　　结论:　　1.不同浓度的5-Aza均可恢复胃癌细胞株GC-7901Klotho基因的表达，呈计量依赖性。　　2.5-Aza恢复胃癌细胞株GC-7901Klotho基因的表达，可诱导胃癌细胞株GC-7901自噬及凋亡增加。　　3.5-Aza恢复胃癌细胞株GC-7901Klotho基因的表达可抑制胰岛素信号通路相关蛋白p-IGF-1R、 p-PI3K、p-mTOR的磷酸化表达，但总蛋白的表达未受影响。　　4.3-MA可以降低5-Aza恢复的GC-7901细胞中Klotho基因的表达，并且使自噬的表达有所减少，细胞凋亡有所减少。　　第三章Klotho真核表达载体的构建并转染胃癌细胞　　目的:　　构建Klotho真核表达载体并转染到胃癌细胞株GC-7901中，检测转染后的表达效率。　　方法:　　本实验首先构建一个Klotho基因的真核表达载体，将Klotho基因片段插入真核表达载体中，形成pZsGreenl-C1-Klotho重组表达载体。用限制性内切酶EcoRⅠ，HindⅢ，BglⅡ，HindⅢ，限制性酶谱分析及基因序列测序分析确定pZsGreenl-C1-Klotho重组表达载体。继而将Klotho真核表达载体转染到GC-7901细胞中，建立高表达Klotho的GC-7901细胞系，采用RT-PCR及Western-blot分析转染后的Klotho基因及蛋白的表达情况。　　结果:　　1.成功构建Klotho真核表达载体pZsGreenl-C1-Klotho，并测序结果正确。　　2.将pZsGreen l-C1-Klotho及对照空白质粒转染GC-7901细胞后，RT-PCR及免疫印记检测Klotho基因及蛋白在各组细胞中的表达，GC-7901及空载体GC-7901细胞中Klotho基因及蛋白低表达，而pZsGreen l-C1-Klotho组中Klotho基因及蛋白的表达显著升高，是前两组Klotho表达的4倍(P＜0.001)，说明转染成功并且有效。　　结论:　　成功构建了Klotho的真核表达载体，并成功转染到人胃癌细胞株GC-7901中，并获得高表达Klotho基因的胃癌细胞株GC-7901。　　第四章Klotho基因对胃癌细胞凋亡、自噬及相关信号通路的作用　　目的:　　研究高表达Klotho基因对胃癌细胞株GC-7901增殖、凋亡、周期、自噬及胰岛素信号通路轴的影响，并对Klotho可能的作用靶点进行分析。　　方法:　　1.实验分为四组: GC-7901细胞株空载体组(blank vector，blank-V)，GC-7901细胞株+转染Klotho载体组(Klotho expressionvector，Klotho-V)，3-MA预处理GC-7901细胞株+转染Klotho载体组（Klotho vector plus3-MA，k-V+3-MA），GC-7901细胞株转染Klotho载体+凋亡抑制剂Z-VAD-FMK组(Z-VAD-PMK，k-V+ZVP)。　　2.CCK实验绘制各组细胞增殖曲线，综合评价高表达Klotho对胃癌细胞株GC-7901增殖能力的影响。　　3.Annexin V-PI流式细胞学检测各组细胞的凋亡和细胞周期情况，评价Klotho对GC-7901细胞凋亡及周期的影响。　　4.Western blot检测 IGF-1R、IRS-1、PI3K、AKT、mTOR和p-IGF-1R、 p-IRS-1、p-PI3K、P-AKT、p-mTOR的表达，研究Klotho对胰岛素信号通路轴的影响。　　5.Westem blot及共聚焦实验检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ的表达，研究过表达Klotho对胃癌细胞株自噬的表达调控。　　结果:　　1.Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测: Klotho-V组细胞增殖明显低于blank-V组(p＜0.001)，k-V+3-MA和k-V+ZVP组细胞增值低于blank-V组(p＜0.001)，但k-V+3-MA和k-V+ZVP组之间无统计学意义(p＞0.05)。　　2.Klotho的表达:blank-V组，Klotho-V组，k-V+3-MA组。Klotho在Klotho-V组表达最高，k-V+3-MA组中Klotho基因表达低于Klotho-V组，而高于blank-V，与第二章中5-AZa处理后给予3-MA组结果相似，说明3-MA可能通过某种机制影响Klotho基因的表达，从而使Klotho的表达有所减少。　　3.Klotho-V组中胰岛素相关信号通路及其下游信号通的磷酸化的表达明显低于blank-V组(p＜0.001)，即p-IGF-1R、p-IRS-1、p-PI3K、P-AKT、p-mTOR的表达明显减少，说明Klotho可以抑制胰岛素信号通路轴中IGF-1R、IRS-1磷酸化表达，磷酸化p-IGF-1R、p-IRS-1受到抑制后从而影响下游p-PI3K、P-AKT、p-mTOR的表达。而k-V+3-MA组中Klotho表达低于Klotho-V的表达，其调控的胰岛素信号通路轴蛋白磷酸化水平亦低于Klotho-V组，说明Klotho对胰岛素信号通路中的调控具有剂量依赖性。而三组细胞株中IRS-1、IGF-1R、PI3K、AKT、mTOR的总蛋白表达无统计学意义(p＞0.05)。　　4.Klotho-V组中细胞凋亡明显高于blank-V组(p＜0.001)，胃癌细胞G0/G1百分比明显增加，细胞周期受到抑制。说明过表达Klotho可以促进人胃癌细胞株GC-7901凋亡，抑制细胞增值。流式细胞技术检测k-V+3-MA凋亡低于Klotho-V组，说明抑制胃癌细胞株自噬表达的结果导致细胞凋亡降低，流式细胞技术检测k-V+ZVP组显示细胞凋亡低于Klotho-V组。说明过表达Klotho组可以促进GC-7901细胞自噬和凋亡增加，但是3-MA可以抑制Klotho-V组自噬的发生，同时降低了胃癌细胞的凋亡率，凋亡抑制剂可以抑制Klotho-V组中细胞凋亡的发生，同时降低胃癌细胞自噬的表达。　　5.共聚焦实验检测blank-V组、Klotho-V组、k-V+3-MA、k-V+ZVP组中自噬的表达，Klotho-V组自噬表达明显上调，但可以被3-MA抑制，凋亡抑制酶同样可以减少自噬的表达，免疫印记检测再次证明过表达Klotho可以增加细胞自噬的表达，自噬抑制剂可以减少过表达组自噬的表达，凋亡抑制剂抑制过表达组凋亡后同时减少了自噬的表达，说明胃癌细胞株GC-7901在Klotho过表达的状态下自噬和凋亡互相促进。　　结论:　　1.外源性高表达Klotho可有效抑制胃癌细胞株GC-7901增殖，促进细胞凋亡，抑制周期;增加胃癌细胞自噬的表达。　　2.Klotho可能通过抑制胰岛素信号通路轴影响胃癌细胞的生物学活性，即抑制IGF-1R磷酸化，从而抑制下游信号通路相关蛋白IRS-1、PI3K、AKT、mTOR磷酸化的表达。