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鸡球虫病是由艾美耳属的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)等7种球虫单独或混合感染肠道不同部位引起的一种肠道细胞内寄生性原虫病。目前,防治鸡球虫病主要依靠抗球虫药物,但长期的使用使球虫产生了耐药性,同时畜禽产品的药物残留影响人类的健康,使得利用免疫防治来取代药物治疗成为控制球虫病的必然。本试验对鸡柔嫩艾美耳球虫(农安株)建立了针对子孢子可溶性抗原的单克隆抗体细胞株并对E. tenella单链的轻重链可变区基因进行了扩增和序列分析。为以后进行E. tenella单链抗体的构建及特异性单链抗体基因与绿脓杆菌外毒素PE40重组毒素的构建、表达及活性测定奠定基础,该重组毒素有望成为对抗柔嫩艾美耳球虫病的新工具。本试验具体研究内容如下：1.鸡柔嫩艾美耳球虫子孢子特异性单抗的制备首先制备鸡柔嫩艾美耳球虫(农安株)子孢子可溶性抗原,即经过卵囊的复壮、收获、体外孢子化、纯化、研磨、胰酶脱囊、DEAE-52层析柱纯化、反复冻融、超声裂解,离心所得上清即为子孢子可溶性抗原。经紫外法测得抗原样品的浓度为330ug/ml。建立针对子孢子可溶性抗原的单克隆抗体细胞株,利用此抗原检测杂交瘤细胞上清液,获得阳性杂交瘤细胞三株4C6、4D8、4E11,并对其进行克隆及扩大培养。2.鸡柔嫩艾美耳球虫子孢子单链抗体可变区基因的扩增与序列分析复苏分泌抗鸡柔嫩艾美耳球虫单克隆抗体杂交瘤细胞,达最佳生长状态后应用琼脂糖扩散法检测该杂交瘤细胞的活性。Trizol法提取活性高的杂交瘤细胞总RNA,琼脂糖凝胶电泳结果显示鸡柔嫩艾美耳球虫特异性杂交瘤细胞基因组RNA提取成功,A260/280值=1.96；根据GenBank上发表的鸡堆型艾美耳球虫单克隆抗体轻重链可变区相关序列(登录号AJ298107),合成特异性引物,以提取的RNA为模板,RT-PCR一步法扩增目的基因,将目的基因与pMD18-T载体连接,经PCR鉴定后,对阳性重组质粒进行测序。结果获得的轻链可变区基因的大小约321bp,重链可变区基因的大小约369bp。测序结果显示符合鸡抗体轻链可变区和重链可变区基因特征,但发现与抗原表位互补结合的互补决定区(CDR)基因有多数发生改变,且在轻链可变区基因的CDR3中有基因缺失现象。