论文部分内容阅读
1.研究背景 创伤后应激心理障碍症（PTSD)的核心症状是恐惧与焦虑，严重危害健康。PTSD的发病是基因与环境、社会因素的综合作用结果。“肾在志为恐”，“恐则气下”，“肾为先天之本”，“肾主生殖、发育”。这些中医中与恐惧、肾有关的中医经典内容为探究PTSD对脏腑气机的损害奠定了理论基础。中医治疗具有身心同调，辨证施治的特点，符合“生物-心理-社会”模式，对 PTSD的治疗具有显著的临床优势。表观异常修饰决定着PTSD的遗传易感性，在行为遗传与神经生物学改变中扮演着跨代与内外环境交互作用之“桥接”角色，也是探索中医调护PTSD“胎损”调护机制的突破点。 2.目的 通过对S D孕鼠模拟PTSD恐惧“胎损”后采取优裕环境（即物理和社会环境）干预，以舒畅情志，模拟中医情志护理，同时给予温补肾阳的金匮肾气丸进行干预；观测宏观行为遗传效应与表达谱、表观遗传（甲基化）测试分析，筛选出中医调护对PTSD恐惧“胎损”可能发生表观遗传学修饰（甲基化异常）的基因，从而揭示中医调护PTSD大鼠恐惧“胎损”的行为遗传学与表观遗传学机制。 3.方法 将72只初次受孕成功的SD雌性大鼠（224.5-260.5g)分成5组（随机数字表法） PTSD组（n=12)、情志组（n=18)、中药组（n=12)、情中中药组（n=18)、正常对照组（n=12)，且这5组孕鼠刚受孕时体重无统计学差异（p>0.05)。采用旷场试验、糖水试验、翻身测试、张耳睁眼测试对子鼠进行行为遗传检测。取第30日子鼠股动脉血进行表达谱芯片检测和甲基化测序，并进行关联分析。 4.结果 4.1.行为测试 旷场试验结果显示PTSD组得分最低（p<0.05)。情志中药组与对照组、情志组、中药组比较均有统计学差异（p<0.05)，说明联合干预优于单项干预。糖水试验结果显示PTSD组的糖水消耗百分比小于对照组（p<0.05)情志组、中药组、情中组糖水消耗百分比亦均大于PTSD组（p’ s<0.05)；而对照组、情志组、中药组、情中组组间相比则没有统计学差异（p’ s>0.05)。翻身测试显示PTSD组的期望值<其余四组的期望值（p<0.05)，且呈情中组、情志组、中药组、对照组、PTSD组，依次递减的变化趋势。张耳睁眼测试结果显示张耳与睁眼情况PTSD组期望小于其余四组且有统计学意义（p<0.05)，且呈情中组、情志组、中药组、对照组、PTSD组依次递减趋势（p<0.05)。 4.2.表达谱结果 在PTSD组V S对照组的比较分析中共得到112条差异基因，其中高表达基因70条，低表达基因42条，涉及到5条 KEGG通路（胞吞、MAPK信号、胆汁分泌、肥厚性心肌病、抗原处理与呈递）。情志干预使得上述112条基因中低表达的31条基因和高表达的66条基因表达调整至正常水平（情志组V S对照组 p^0.05)。中药干预使得上述112调基因中低表达的21条基因和高表达的32条基因表达经复调整至正常水平（中药组V S对照组p^0.05)。而情志中药联合干预使得上述112调基因中低表达的25条基因和高表达的61条基因调整至正常水平（情中组V S对照组p^0.05)。将情志组、中药组、情中组这三组的起效基因进行关联分析，发现共有24条基因同时出现，但仅涉及到MAPK信号通路(N tf3与Pla2g5基因）。 4.3.甲基化测序 在PTSD组V S对照组对比分析中共发现高甲基化基因943条，低甲基化基因1775条。这些基因与上述112条差异化基因关联分析共筛选出11条基因，且呈显著负相关（Pearson Correlation R=-0.617，p<0.05)。其中低甲基化且高表达的基因（edgeR.log2FC<-1，log2FC多1)有：T tr、Tsg101、Itgb6、Rtn4rl1、Sostdc1、Epn3；而高甲基化且低表达的基因（edgeR.log2FC彡1，log2FC彡-1)有：Cd300a、Wdfy3、Myh2、N tf3和 F5。在情志组VS PTSD组发现低甲基化基因1390条，高甲基化基因869条（p<0.05)。将这些基因与上述97条起效基因关联分析只筛选出3条基因即Rtn4rl1、Hmha1、Wdfy3。在中药组VS PTSD组发现其中低甲基化基因730条，高甲基化基因共891条（p<0.05)，将这些基因与上述53条起效基因关联分析只筛选出N tf3基因。在情中组VS PTSD组发现低甲基化基因1558条，高甲基化基因1631条（p<0.05)，与上述86条差异表达基因关联分析共筛选出4条差异表达基因即Itgb6、Epn3、Hmha1、N tf3。 5.结论 5.1.母鼠孕期PTSD模拟可导致子鼠行为能力变差；中医情志调护与补肾中药可纠正母鼠PTSD导致的子鼠行为发育迟缓，情志联合中药的调护效果可能比单一干预的效果更好。 5.2.母鼠孕期PTSD模拟可导致子鼠的多个基因表达谱异常，情志、中药干预、情志联合中药可从不同角度纠正这些异常。MAPK通路是情志和中药干预起效的共同基础，N tf3与Pla2g5基因是M A P K信号通路的关键基因。 5.3.母鼠孕期PTSD模拟导致的子鼠基因表达异常与其甲基化水平不同有关，表观遗传修饰可能是PTSD“胎损”及其情志、中药调护的关键机制。