研究背景及目的恶性肿瘤已经成为严重危害人类健康和导致人类死亡的常见疾病,给家庭和社会的经济发展造成沉重负担。据世界卫生组织(WHO)发表的《2014全球癌症报告》,全球每年新增癌症病例将呈现迅猛增长的趋势,2012年全球新增患癌人数为1400万人,至2025年全球新增患癌人数将高达1900万人；其中,2012年中国新增癌症患者约307万人,癌症死亡患者约220万人,分别占全球总病例的21.9%和26.8%,高居全球第一位。目前肿瘤的预防和诊治己成为全球最大的公共卫生问题。随着肿瘤分子生物学的迅猛发展,肿瘤基因在恶性肿瘤的筛查、诊断、治疗、预后评估、疗效监测等各方面发挥着越来越重要的作用。肿瘤的发生发展过程始于肿瘤基因点的突变,到导致细胞的无限分裂,直至细胞发生恶化、迁移。对健康人群定期进行肿瘤相关基因的筛查,尤其是患癌高危人群,有利于实现“早发现、早诊断、早治疗”,为癌症患者赢得更多的生存机会。经临床肿瘤诊治经验的长期积累,研究者已发现化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效应与特定的基因表达或基因多态性显著相关,通过基因诊断可为患者选择最佳的治疗方案,提高患者的治疗效果和生存质量。近年来,分子靶向治疗在临床上取得显著的成效,为肿瘤的诊治提供了一种新的有效的治疗模式。分子靶向药物治疗主要是利用小分子化合物、多肽、单克隆抗体等物质靶向作用于与肿瘤发生、发展、预后等密切相关的特异分子,从而抑制细胞生长因子受体的激活、信号通路传导以及血管生成,特异性地干预肿瘤细胞生物学行为,达到抑制肿瘤发展的目的。分子靶向药物具有高度选择性地杀死肿瘤细胞而不杀伤或仅很少损伤正常细胞的特点,毒副作用相对较小,可有效地改善患者的生活品质和治疗效果。由于恶性肿瘤在分子水平上存在高度异质性,其发生发展是多基因、多型态、多步骤相互协同作用的结果,因此在采用靶向药物治疗方案之前,需明确患者是否存在相应的靶点,以此指导恶性肿瘤患者个体化靶向治疗,提高用药的安全性和有效性。相对于目前其他常见的基因诊断方法,新一代测序技术具有通量高、成本低、速度快、操作简单、利用单一平台即可实现全面深入的基因检测等优点,现己从实验室研究逐渐走向临床应用。新一代测序技术一-Ion Torrent测序技术,是以半导体芯片技术为基础,利用碱基互补配对的天然原理,通过离子传感器捕获DNA合成时碱基延伸释放H+而导致局部的pH变化,并即刻将化学信号转化为数字信号,以此实时判读碱基,最终获得每个DNA片段的碱基序列。相比起其他测序技术,Ion Torrent测序技术突破了传统上依靠荧光标记以及光学图像采集数据原理的技术限制,使得其在设备成本、测序速度、测序费用上具有不可比拟的优势。本研究采用Ion Torrent测序技术检测恶性肿瘤患者的22个肿瘤基因,即EGFR, ERBB2, ERBB4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, MET, ALK, KRAS, NRAS, BRAF, STK11, MAP2K1, PTEN, PIK3CA, AKT1, DDR2, TP53, CTNNB1, SMAD4, FBXW7, NOTCH1,并通过Sanger测序法、ADx-ARMS法对EGFR, KRAS, BRAF部分基因位点的检测结果进行验证,以评价Ion Torrent测序技术在肿瘤基因检测上的准确性和临床适用性。方法：1.研究对象的收集 收集110例恶性肿瘤患者的石蜡包埋肿瘤组织样本和96例临床上已根据诊治需求采用ADx-ARMS法检测过EGFR, KRAS或BRAF基因突变结果的恶性肿瘤患者的肿瘤DNA样本,本研究总共有206例样本。2.DNA提取及浓度的初步定量 采用德国QIAGEN公司的QIAampDNA FFPE Tissue Kit试剂盒提取110例恶性肿瘤患者的石蜡包埋组织样本；采用Qubit(?) 3.0对206例DNA样本进行初步定量。3.根据Life Technology公司的AmpliseqTM Colon and Lung Cancer panel标准流程对DNA样本进行文库构建、模板制备及富集,之后在Ion Proton System上进行测序。4.对Ion Torrent测序技术的检测数据进行分析。5.采用Sanger测序法检测206例样本的EGFR、KRAS、BRAF三个基因,对其检测所覆盖的39种常见突变型别进行判读和报告,并与Ion Torrent测序技术的检测结果进行比对分析。6. 比对分析临床上已采用ADx-ARMS法检测的EGFR, KRAS或BRAF基因突变结果的96例样本与Ion Torrent测序技术检测结果的一致性。结果：1.本研究中206例恶性肿瘤患者的样本,在性别比例上,男性131例,约占65.6%,女性75例,约占36.4%；在年龄构成上：在23～90岁之间,平均年龄为63±12岁,其中年龄<65岁有114例,约占53.3%,年龄≥65岁有92例,约占46.7%；在癌症类型上：肺癌72例,约占34.9%,肠癌104例,约占50.5%,恶性黑色素瘤30例,约占14.6%；在样本类型上：石蜡包埋肿瘤组织有126例,约占61.2%,冰冻组织有69例,约占33.5%,活检组织有4例,约占1.9%,胸水有7例,约占3.4%。2.经Ion Torrent测序技术检测22个肿瘤基因,其结果是： (1)206例样本测序读数的平均值为1592934±302945.3X,最小值为482469；测序平均深度的平均值为15753X±3082.638X,最小值为4826X；测序一致性的平均值为97.1%±2.30%,最小值为84.14%；被检测到的最小突变频率为1.6%。测序读数、测序平均深度在三种不同癌症类型组间的差异有统计学意义(P<0.01),在四种不同样本类型组间的差异无统计学意义(P>0.05)；测序一致性在三种不同癌症类型组间的差异无统计学意义(P>0.05),在四种不同样本类型组间的差异有统计学意义(P<0.01)。(2)22个肿瘤基因突变率位于前六的依次是EGFR (100%)、FGFR3 (100%)、TP53 (85.4%)、ERBB4 (67.0%)、DDR2 (50.5%)、 KRAS (31.6%);而FGFR2、MAP2K1基因均未检测到发生突变。通过比较基因突变率在三种不同癌症组间的突变率差异,仅有KRAS和BRAF基因的差异存在统计学意义,且KRAS基因突变在肠癌患者中的检出率较高(P<0.01)；BRAF基因突变在恶性黑色素瘤患者中的检出率较高(P<0.01)。(3)同一肿瘤患者被检出同时发生突变的基因数至少有2个,平均有5个。 (4)除了MAP2K1、FGFR2基因,其他的20个肿瘤基因被检出至少有1种,至多有69种不同的突变型别。其中,TP53基因被检出的突变型别最多,有69种；其次是EGFR基因,有19种；PTEN、KRAS、SMAD4、FBXW7、PIK3CA基因,均有10种以上；且这部分基因都存在其中的一种突变型别有较高的突变率,其突变例数占该基因总体突变例数的比率在21.4%,--100%之间。而ERBB2、AKT1、 NOTCH1基因被检出的突变型别种数和突变例数一致,即每一例突变均为不同的突变型别。 (5)基因突变主要以单型别突变为主。MET、STK11、BRAF、 FBXW7、ALK、NRAS、CTNNB1、ERBB2、FGFR1、AKT1、NOTCH1共11个基因在同一肿瘤患者上被检出的均为单型别突变；SMAD4、PIK3CA、ERBB4、 DDR2、KRAS、FGFR3共6个肿瘤基因被检出有单型别、双型别突变,且单型别突变率在92.3%"--99.5%之间；而TP53、EGFR基因被检出均有单型别、双型别、三型别、四型别突变,PTEN基因被检出有单型别、双型别、六型别突变,其单型别突变率依次是54.6%、41.5%、85.7%。3.经Sanger测序法检测206例样本的EGFR,KRAS, BRAF基因,其39种常见突变型别的检测结果如下：(1)EGFR, KRAS或BRAF基因突变型有96例,占46.6%,EGFR, KRAS或BRAF基因均为野生型有110例,占54.6%。(2)96例突变型样本均为单个基因突变,其中EGFR基因突变有33例,占16.0%,KRAS基因突变有55例,占26.7%,BRAF基因突变有8例,占3.9%。 (3)EGFR基因突变的33例样本均为肺癌样本,其中18号外显子突变有2例,占6.1%,19号外显子突变有8例,占24.2%,20号外显子突变有1例,占3.0%,21号外显子突变且均L858R突变有20例,占60.6%,20号外显子和21号外显子双突变有2例,占6.1%。(4)55例KRAS基因突变样本中,肠癌样本51例,占92.7%,主要为Gly12Asp、Gly13Asp、Gly12Val突变；肺癌、恶性黑色素瘤样本各2例,各占3.6%。 (5)8例BRAF基因突变样本均为V600E突变,其中肠癌样本5例,占62.5%,恶性黑色素瘤样本3例,占37.5%。4. Ion torrent测序技术与Sanger测序法检测结果相比,Ion torrent测序技术检测结果是EGRF/KRAS/BRAF基因突变的样本有101例,占49.0%,EGRF/KRAS/BRAF基因野生型有105例,占51.0%。206例中共有5例其两种方法的检测结果不一致,包含3例EGFR基因、1例KRAS基因、1例BRAF基因。Ion torrent测序技术的灵敏性为100%,特异性为95.5%,粗一致性为97.6%,KAPAA值为0.951(P<0.01)。通过分析基因突变的101例样本,发现两者结果一致的96例样本其Ion torrent测序突变频率均在5%以上,结果不符的5例样本,其Ion torrent测序突变频率均在5%以下。5. Ion Torrent测序技术与ADx-ARMS法检测结果相比,96例ADx-ARMS法检测结果是EGRF/KRAS/BRAF基因突变的样本有67例,占69.8%,EGRF/KRAS/BRAF基因野生型的样本有29例,占30.2%；Ion Torrent测序结果为EGRF/KRAS/BRAF基因突变的样本有60例,占62.5%,EGRF/KRAS/BRAF基因野生型的样本有36例,占37.5%；其中有7例其两者的检测结果不一致,两者基因突变型符合率为89.6%,基因野生型符合率为100%,粗一致性为92.7%,KAPPA值为0.838(P<0.01)。结论：本研究采用Ion torrent测序技术成功地检测了206例恶性肿瘤患者的22个肿瘤基因,并通过Sanger测序法、ADx-ARMS法对EGFR, KRAS, BRAF基因部分突变位点的验证试验,证实了Ion torrent测序技术具有较高的特异性和灵敏性,适合大规模地应用于恶性肿瘤的早期筛查和个体化诊治。