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还原型谷胱甘肽(GSH)是机体内重要的活性物质,是许多酶反应的辅基,具有清除自由基、解毒等多种生理功能。本文对利用啤酒废酵母作为原料提取GSH进行了研究。
首先考察了不同破壁方法对啤酒废酵母细胞壁进行破壁并制备含GSH的抽提液,确定采用对羟基苯甲酸酯法抽提啤酒废酵母菌细胞中的GSH。用此方法从啤洒废酵母细胞中提取还原型谷胱甘肽目前未见文献报道。试验结果表明:对羟基苯甲酸酯法抽提啤酒废酵母菌细胞中GSH的最佳抽提条件为:按菌体与破壁液比例1∶2(W/V)加入0.5%的对羟基苯甲酸丙酯,30℃,pH5-pH6,搅拌3h。在最适抽提条件下,GSH在破壁离心后上清液中平均含量可达96.71mg/100mL,平均破壁率66.80%。
其次制备了以壳聚糖为载体、Cu2+螯合亲和层析介质,用此亲和层析介质固定化金属螯合亲和层析法从啤酒废酵母中分离纯化GSH目前未见文献报道。同时使用005×7阳离子交换树脂为介质的离子交换法纯化GSH作为与亲和层析法的对比。重复扩大试验结果确定了固定化金属螯合亲和层析法纯化GSH的最佳分离纯化条件,即采用pH4.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/LNH4Cl)为洗脱液,洗脱流速为2.5ml/min。此法所得粗品颜色为白色。经过重复试验确定了离子交换法纯化GSH的最适分离纯化条件,即上柱pH3.0,洗脱流速为2.4ml/min,洗脱液为0.5mol/L的NH4Cl溶液。此法所得料品纯度低,颜色为淡黄色。采用固定化金属螯合亲和层析法纯化GSH的平均收得率为62.5%,所得GSH纯度为49.8%,此法的平均收得率虽然比离子交换法纯化GSH的平均收得率60.3%仅高2.2%,但是所得粗品的纯度远远高于离子交换法所得的料品纯度8.19%。同时此法操作时无需强酸强碱对介质进行预处理及再生,对环境污染很小,比离子交换法优越。
最后以HPLC法为标准,考察了测定GSH含量的DTNB法的准确性。对于同一GSH标准品和同一GSH产品检测,结果表明DTNB法检测GSH准确度较高,且DTNB法操作方便,可在日常研究中使用。