龋病是在以细菌为主的多因素影响下,牙体硬组织发生慢性进行性破坏的一种疾病。人类口腔中主要致龋菌是变形链球菌和茸毛链球菌,能在牙面上定植增殖,形成菌斑进而导致龋病的发生,产酸、耐酸、合成胞外葡聚糖是其致龋的三大特点。已有的研究表明采用特异性降解菌斑多糖基质的水解酶可以有效地控制致龋菌在宿主牙面上的定植,达到预防龋齿的目的。然而在国内有关这种防龋途径的研究非常缺乏。 本研究首次发现哈茨木霉菌Trichoderma harzianum Thl(中国山东省土壤中分离)具有产生非水溶性葡聚糖酶的能力,初步提纯Trichoderma harzianum Thl非水溶性葡聚糖酶,研究其理化特性且对该酶基因进行了克隆测序。实验中观察了非水溶性葡聚糖酶对主要致龋菌生长、黏附和生物膜形成的影响,并使用激光共聚焦显微镜观察了在多细菌参与的菌斑生物膜形成过程中加入非水溶性葡聚糖酶后菌斑结构的改变,随后对洗必泰杀菌效果的比较探讨了菌斑生物膜结构的改变与膜内细菌抗药性的关系。通过将非水溶性葡聚糖酶局部应用于致龋动物模型中,探索特异性哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶对龋病发生发展的影响,以期寻求一种简便、有效的防龋方法。 本研究分以下三部分进行: 第一部分 哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶的理化性质及基因分析 本实验使用诱导产酶培养基从六株中国境内分离的木霉菌菌株中选择到一株能够产生非水溶性葡聚糖酶的菌株——哈茨木霉菌Trichoderma harzianumThl。该菌株自中国山东土壤中分离,能在较短的时间内(72h)产生较高的酶活性(0.071U/ml)。采用硫酸铵饱和沉淀法初步提取该酶,与粗酶液相比,纯度提高了1.8倍。对非水溶性葡聚糖酶粗提物一般特性的研究中发现,该酶最佳反应温度为40℃,最适反应pH值为5.5,以内切方式作用于底物,属于内切非水溶性葡聚糖酶。