本研究分为二部分： 第一部分 肝癌癌蛋白p28GANK正反馈调节对β-catenin信号通路的作用与机制研究 研究背景与目的： 肝细胞性肝癌(简称肝癌,Hepatocellular Carcinoma,HCC)是我国最常见的高发肿瘤之一,其发生发展是由体内多基因参与、多步骤协同的复杂过程。目前,尽管已经鉴定了一些肝癌相关的抑癌基因,如p53和p16INK4a,并明确了它们在肝癌中的特异性失活,但是在肝癌发生中特异性激活的癌基因却少见报道。 β-连环蛋白(β-catenin)是一种重要的肿瘤相关基因,除了在细胞粘附中有重要作用外,还是Wnt信号通路的重要功能分子。通过在不同时间、空间上的差异表达调节一系列下游基因c-myc和cyclin-d1等的表达水平,参与细胞增殖、凋亡以及器官发育。近来研究发现,β-catenin在肝癌发生早期呈现异常聚集,并能够促进肝癌的发生以及早期肝癌细胞的快速生长。因此探讨β-catenin在肝癌发生发展中的作用具有重要价值。已有研究表明提高野生型p53水平可以明显下调β-catenin蛋白水平。结合新近研究发现p28GANK能与泛素蛋白连接酶MDM2相互作用,介导野生型p53蛋白的泛素化及降解,提示在肝细胞癌的发生发展中可能存在着癌蛋白p28GANK与β-catenin的相互联系。因此我们探讨了Wnt/β-catenin信号通路激活对p28GANK表达的影响以及p28GANK对β-catenin信号通路的调节作用。 实验方法： 1.采用Genomatix在线分析软件分析p28GANK启动子区并构建p28GANK报告基因质粒； 2.运用双荧光素酶报告基因系统检测生长因子刺激对p28GANK转录活性的影响；采用瞬时转染方法观察Ras对p28GANK转录活性的影响；应用报告基因系统结合ERK与PI3K信号通路抑制剂确定生长因子与Ras对p28GANK表达的调节通路；采用瞬时转染β-catenin和c-Myc表达质粒确定它们对p28GANK表达的影响； 3.通过Luciferase报告基因质粒pGL-OT(含有β-catenin/TCF4复合物特异结合区)与不同剂量p28GANK质粒细胞共转染实验,确定p28GANK对β-catenin/TCF4转录活性的影响； 4.运用western blot及核浆分离技术,检测HEK293细胞瞬转p28GANK后,β-catenin在胞核胞浆中的分布变化； 5.运用western blot和转染技术研究生长因子、Ras、AKT、β-catenin、c-Myc对p28GANK蛋白表达调节作用；应用RT-PCR技术研究生长因子、Ras、AKT、β-catenin、c-Myc等对p28GANK表达的调节作用； 6.运用染色质免疫共沉淀(ChIP)技术研究β-catenin和c-Myc与28GANK启动子区相互作用关系； 7.应用腺病毒介导的RNA干扰技术下调表达肝癌细胞系中p28GANK的水平,探讨其对β-catenin转录活性的作用,并进一步研究了p28GANK对自身转录水平的影响。 8.应用临床肝癌组织标本应用western blot和免疫组织化学方法检测β-catenin、c-Myc、cyclinD1表达水平与p28GANK蛋白表达水平之间的关系。 结论： 生长因子刺激或Ras激活可以上调肝癌癌蛋白p28GANK的表达,这种激活作用可能是通过激活PI3K-AKT通路完成的。β-catenin和c-Myc的上调表达都能够促进p28GANK的表达,并且染色质免疫沉淀实验证实β-catenin/TCF4可以与p28GANK启动子直接结合。进一步实验表明上调的p28GANK可以反过来进一步促进β-catenin蛋白的稳定从而上调β-catenin/TCF4转录活性。在肝癌组织样品中p28GANK的蛋白水平与β-catenin、c-Myc和cyclinD1呈同向性表达。上述结果支持我们提出的p28GANK正反馈调节β-catenin信号通路的结论。 第二部分 信号调节蛋白α负性调节I型干扰素产生的作用和机制研究 研究背景与目的： 信号调节蛋白α(signal regulatory protein α,SIRPα)是一种广泛存在的抑制性受体,属于免疫球蛋白受体超家族。其胞外区具有三个Ig样结构域和多个糖基化位点,胞内区带有免疫受体酪氨酸抑制基元(ITIMs),其中含四个酪氨酸残基,被磷酸化后能够募集含SH2结构域的蛋白磷酸酶SHP-1和SHP-2。 干扰素(interferon IFN)是一类广泛表达具有潜在抗病毒感染的细胞因子。但是过度失控的诱导产生IFN还将易导致自身免疫性疾病的发生。所以,对于IFN表达系统的调控对于维持机体内稳态相当重要。IFN的诱导产生依赖于机体模式识别(pattern recognition receptors PRRs)受体的激活。天然免疫系统识别病毒双链RNA可以通过两条途径:TOLL样受体(toll like receptors,TLR)3和胞浆途径(RIG-I/MDA5)。TLR3作为一种重要的模式识别受体,主要表达于巨噬细胞和树突状细胞内涵体内,能够识别细胞吞噬进入的dsRNA。RIG-I/MDA5能够识别病毒复制过程中产生的dsRNA。TLR3和RIG-I/MDA5都能够与dsRNA的类似物poly(I:C)(polyriboinosinic:polyribocytidylic acid)结合,从而介导I型IFN产生。本课题主要探讨了SIRPα对poly(I:C)活化巨噬细胞的调节作用和机制。 SIRPα在免疫细胞只选择性地表达在巨噬细胞和树突状细胞等非淋巴细胞。我们研究发现poly(I:C)刺激巨噬细胞SIRPα蛋白表达水平下降,提示该蛋白对巨噬细胞激活及I型IFN产生可能存在抑制作用。为进一步了解该蛋白在天然免疫功能中的作用和机制,本课题通过转染并筛选克隆建立稳定高低表达该蛋白的巨噬细胞系及瞬时干扰小鼠体内分离的巨噬细胞中的SIRPα表达,探讨了SIRPα对poly(I:C)诱导的小鼠巨噬细胞活化的影响,全面探讨了SIRPα对TLR3和胞浆途径介导的I型IFN产生的调节作用；并探讨SIRPα对巨噬细胞MAPKs信号分子,分泌细胞因子的影响,并进一步探讨了SIRPα发挥上述作用的可能机制,确定了SIRPα在I型干扰素诱导产生中的重要调节作用,并为尚未阐明的抑制性受体家族胞内信号转导机制提供新的线索。 实验方法： 1.建立稳定转染空载体,高表达Myc-SIRPα及稳定干扰SIRPα的巨噬细胞系：RAW-VT,RAW-OV,RAW-KD,设计,合成并鉴定具有干扰效果的stealthRNA,分别干扰SIRPα,和SHP-2; 2.采用磷酸化特异性抗体检测不同SIRPα表达对poly(I:C)刺激后p38,JNK,ERK,IRF3及AKT磷酸化水平的变化的影响来反映SIRPα对通路活化的影响； 3.运用荧光素酶报告基因系统检测SIRPα对ISRE、PRDⅡ、PRDⅢ-I、RANTES和NF-κB转录活性的作用； 4.采用Real-time PCR方法检测sirpa基因转录水平变化和RT-PCR检测ifn-β及其相关诱导基因变化； 5.通过ELISA检测细胞因子变化； 6.采用免疫沉淀的方法确定与SIRPα相互作用的蛋白。 7.采用瞬时干扰SHP-2后检测其对巨噬细胞释放细胞因子和对信号通路磷酸化的影响确定这个蛋白在巨噬细胞激活中的作用。 8.采用免疫共沉淀的方法检测SIRPα不同表达是否影响SHP-2和下游相互作用蛋白的结合。 结论： 本研究从分子水平全面深入研究了信号调节蛋白SIRPα对TLR3和胞浆途径介导的I型干扰素表达的调节作用,发现SIRPα对poly(I:C)诱导的I型干扰素及其它细胞因子分泌等生物学行为具有负向调控能力,详细探讨了其影响相关信号转导通路的作用机制,证明其可能部分通过抑制P13K-AKT信号通路调节作用而发挥负向调控作用。