【摘 要】
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近年来,纤维二糖磷酸化酶(CBP)受到广泛关注。纤维二糖磷酸化酶属于糖苷水解酶94家族,能够专一性作用于β-1,4-糖苷键,以磷酸解途径水解纤维二糖生成α-D-葡萄糖和α-D-葡萄
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近年来,纤维二糖磷酸化酶(CBP)受到广泛关注。纤维二糖磷酸化酶属于糖苷水解酶94家族,能够专一性作用于β-1,4-糖苷键,以磷酸解途径水解纤维二糖生成α-D-葡萄糖和α-D-葡萄糖-1-磷酸(G-1-P),在生物燃料的生产和糖苷的合成中具有很好的发展前景。本实验以纤维二糖为唯一碳源,通过酶活测定,筛选出一株产纤维二糖磷酸化酶的菌株,对其产酶条件进行研究。然后采用基因克隆的方法从两株嗜热菌的基因组DNA中克隆得到目的基因,使其在大肠杆菌表达系统中进行异源表达,并对异源表达产物进行分析,结果如下:(1)筛选出的纤维二糖磷酸化酶产生菌BY-α为棒状的革兰氏阴性菌,经16S核糖体RNA序列分析其属于克雷伯氏菌属(Klebsiella)。(2)通过发酵条件优化,确定BY-α最佳发酵产酶温度为37℃,发酵时间为24h,培养基装液量为30mL/250mL,摇床培养。(3)根据数据库公布的TaCBP和TpCBP基因序列,设计引物,PCR扩增出大小合适的核酸片段,双酶切酶连,提取质粒测序。得到蛋白序列与数据库信息完全相同的TaCBP蛋白,以及具有四个氨基酸突变的TpCBP蛋白。(4)两个目的基因在大肠杆菌中诱导,收集菌体超声破碎,通过SDS-PAGE检测,发现目的基因在大肠杆菌中成功表达,表达蛋白纯化后的浓度为0.0527mg/mL、0.0496mg/mL。(5)对纯化后的纤维二糖磷酸化酶的酶学性质进行研究,来自Thermotoga petrophila的酶最适pH为7.5,最适温度为80℃,半失活时间为48.29min;来源于thermosipho africanus TCF52B的酶最适pH为8.0,最适温度为75℃,半失活时间64.66min。(6)经过酶促动力学分析,调节D-木糖浓度时,两个酶的Vmax分别为5.22μmol/ml*min、4.44μmol/ml*min,Km值分别为6.37mg/ml、5.18mg/ml,kcat值分别为30.831/s、34.261/s。调节G-1-P浓度时,两个酶的Vmax分别为3.54μmol/ml*min、3.78μmol/ml*min,Km值分别为2.73mg/ml、2.68mg/ml,kcat值分别为15.49/s、17.32/s。
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