研究背景： 口腔扁平苔藓(oral lichen planus，OLP)是常见的口腔疾病之一，其病因仍不清楚。其临床特点是病程迁延，反复发作，严重影响患者的生活质量；部分反复发作的病损可发展为口腔鳞癌，WHO已将其定义为一种癌前状态。OLP的发病与精神、内分泌、免疫、感染等多种因素有关，其中免疫因素是OLP发病最为重要的机制之一，T细胞介导的特异性免疫、非特异性免疫及免疫调节机制的异常参与了OLP发病。本课题组在最近的研究中，发现OLP病损局部IFN-γ、IL-4表达均升高，我们的研究结果提示OLP病损局部并不存在Th1／Th2分化失衡。由此可见，OLP患者可能存在其它更为重要的免疫调节机制的异常。当前，我国OLP的基础与临床研究与国外已基本趋于同步，某些领域甚至处于领先地位。尽管近年来OLP的研究已取得了显著的成果，但仍未有突破性进展。这主要与几个方面的不利因素有关，包括病因非常复杂、缺乏动物模型、难于获得足够的临床病理标本等等。如何从OLP繁多的致病因子中筛选出的关键因子、如何从十分有限的临床组织标本中最大限度地获取致病基因表达变化情况，这一直以来都是国内外学者们关注的热点问题。基因芯片又称DNA微阵列(DNA Microarray)，是在载体上有序地固定大量靶基因片段或寡核苷酸片段而形成的高密度DNA阵列，可在一次实验中对基因序列及其功能开展大规模、高密度研究。基因芯片技术的高通量、高精度、高效率在差异表达基因的筛选中得到了广泛的应用，其所揭示的基因表达谱可以提供相当丰富的信息。该技术已经广泛的应用于人类各种疾病的研究，如肿瘤、心血管疾病、发育性疾病、炎症及自身免疫性疾病等。可见，基因芯片以其固有的优势可能克服上述OLP研究存在的困难和瓶颈，为OLP的研究带来新的希望。 1.研究目的： 应用人全基因组芯片检测OLP患者全病损基因组表达情况，筛选并构建OLP病损差异表达基因谱，同时进一步对差异表达基因进行功能聚类(Gene Ontology,GO)分析、生物学通路(Pathway)分析，以期初步明确OLP病损差异表达基因谱的特征，为揭示OLP的分子病理机制提供初步的研究依据。 2.研究方法： 选取我院黏膜科就诊OLP患者9例，要求患者在活检前3月内均未进行任何治疗，无口腔局部及全身系统性疾病。正常对照9例，组织来源于同期口腔颌面外科正颌手术多余黏膜组织。Trizol法提取组织总RNA，质检合格后送北京博奥生物有限公司(生物芯片北京国家工程中心)完成芯片检测。本研究应用的人类全基因组寡核甘酸芯片为美国Affymetrix公司HG-U133+2.0基因芯片体系，含有超过54000条基因探针组，代表着40500余条基因。 3.研究结果： OLP与正常对照之间总共有6907条基因探针存在2倍以上的差异表达，其中在3组比较中均存在差异表达的基因探针有1692条，包括1120条基因探针表达信号上调和572条探针表达信号下调。进一步分析表明，在OLP患者中共同差异表达的1692条探针代表着1244条基因，其中功能明确的基因有985条，包括629条基因表达上调(2～73倍)、356条基因表达下调(-2～-327倍)，如MMP1、FOXP3、VEGFA、ANGPT1、CXCL13、CXCL1、Mammaglobin A(SCGB2A2)、histatin 1(HTN 1)等。 4.结论： 口腔扁平苔藓(OLP)是多种基因同体作用的结果，GO分析表明差异表达基因涉及蛋白水解、细胞增殖、细胞粘附、血管形成、免疫反应、炎症过程、凋亡及细胞趋化等众多功能基因群，这些功能相关基因在疾病发生发展中起重要作用。生物学信号通路分析提示，OLP发病相关基因的作用路径十分复杂，涉及诸如Toll-like receptor signaling pathway、IL-17 signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway、Apoptosis、VEGF signaling pathway等100余条生物学信号通路，这些信号通路基因相互协调作用参与了疾病的发病。 1.研究目的： 分别从mRNA及蛋白水平验证芯片研究发现的血管形成相关基因VEGF-A、ANGPT-1，-2的表达变化，分析不同临床类型OLP病损之间微血管密度、VEGF-A、ANGPT-1，-2表达的情况，以期初步阐明血管形成异常及其机制与OLP发病、病情及临床类型间的关系，为今后应用抗血管生成治疗OLP提供初步的研究依据。 2.研究方法： 荧光定量RT-PCR检测9例OLP患者及9例对照组织VEGF-A、ANGPT-1，-2mRNA水平，IHC、ELISA检测另30例OLP样本及6例对照样本组织微血管密度、VEGF-A、ANGPT-1，-2蛋白表达。 3.研究结果： 荧光定量RT-PCR结果显示，OLP病损组织VEGF-A、ANGPT-1转录水平显著高于正常对照组织，这与基因芯片检测结果相似；而ANGPT-2转录水平出现下降，与基因芯片结果有所不同。 IHC检测发现，OLP患者病损组织局部微血管密度显著高于正常对照(P=0.033)。将OLP患者进一步分成充血-糜烂组及斑纹组，统计结果显示充血-糜烂组患者微血管密度高于斑纹组患者及正常对照(P=0.001，P=0.042)，而斑纹组OLP患者与正常对照间微血管密度差异无显著性(P=0.065)。 VEGF-A的IHC检测结果表明，阳性细胞主要位于黏膜上皮深棘层及基底细胞层，呈连续带状分布。尽管VEGF-A在疾病组与对照组之间阳性表达分布模式是相似的，但萎缩-糜烂组与斑纹组OLP病损组织VEGF-A表达强度明显高于对照组织。ELISA检测结果表明，患者未分组时，OLP患者局部病损组织VEGF-A表达显著高于对照组(P<0.0001)；而将患者分为萎缩-糜烂与斑纹两个组时，两组OLP患者局部组织VEGF表达均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.0001，P=0.008)。但是，萎缩-糜烂OLP组与斑纹OLP组间VEGF表达无显著性差异(P=0.106)。Pearson相关分析结果显示，在正常对照、OLP患者局部组织中，微血管密度与VEGF的表达具有显著相关性。正常对照组织MVD与VEGF相关系数为0.84(P<0.0001)，OLP组为0.887(P<0.0001)，萎缩-糜烂OLP组为0.917(P<0.0001)，斑纹OLP组为0.88(P<0.0001)。 4.结论： 本研究与前述芯片检测结果相似，提示VEGF-A/ANGPT1介导的血管形成增加参与了OLP疾病的发生发展，与疾病病情及临床类型有关；ANGPT2在OLP病损新生微血管过程中的意义尚有待进一步研究。 1.研究目的： 分别从mRNA及蛋白水平验证芯片研究发现的CD4+CD25+Treg细胞特异性标志FOXP3的表达变化，分析不同临床类型OLP病损之间CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞分布情况及治疗前后外周血中细胞比例的变化，以期初步阐明CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞与OLP发病、病情及临床类型间的关系，为今后选择性扩增CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞治疗OLP提供初步的研究依据。 2.研究方法： 荧光定量RT-PCR检测9例OLP患者及9例对照组织FOXP3 mRNA水平，IHC检测另20例OLP、5例慢性牙龈炎及6例对照样本组织CD4+、CD25+、FOXP3+、CD4+FOXP3+、CD25+FOXP3+细胞分布情况，流式细胞术检测3例OLP患者治疗前后外周血中CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例。 3.研究结果： 荧光定量RT-PCR结果提示OLP患者病损FOXP3表达显著高于正常对照组织，平均上升达23.16倍，这与基因芯片(平均上升3.61)检测变化趋势一致。 同以往研究报道相似，我们观察到绝大部分FOXP3阳性细胞呈CD4阳性表达，并且仅少数CD25弱阳性细胞FOXP3表达阴性，提示FOXP3主要表达于CD4+CD25+双阳性细胞群。在正常对照口腔黏膜组织中，难以检测到CD4、CD25、FOXP3阳性细胞；而OLP病损组织存在大量CD4、CD25、FOXP3阳性细胞，主要分布在黏膜固有层。进一步分析发现，充血-糜烂型OLP患者病损组织FOXP3+细胞密度显著低于网纹型病损(P=0.002)及慢性牙龈瘤病损(P=0.04)，而网纹型OLP病损与慢性牙龈瘤病损间差异无显著性(P=0.14)，见表3.2。Pearson相关性分析显示，OLP患者病损组织FOXP3+细胞密度与疾病病情呈显著负相关，相关系数-0.557(P=0.013)。流式细胞术检测结果表明，OLP患者经过系统治疗后外周血中CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例明显升高。 4.结论： CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞在OLP的发病中具有重要作用，与疾病类型及病情相关，选择性扩增或诱导CD4+CD25+Treg细胞向病损迁移可能成为治疗OLP的新策略。