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金葡菌是奶牛乳房炎主要病原菌之一,金葡菌感染是奶牛临床防治的难点,给奶牛养殖业造成巨大经济损失。生物被膜形成能使细菌具备更强耐药性,被认为是难以有效清除金葡菌的重要因素。本文从患乳房炎奶牛乳汁中分离金葡菌,测定乳房炎防治常用抗菌药物的MIC,利福昔明与不同抗菌药物的FIC,并测定利福昔明对金葡菌的PAE。之后研究金葡菌生物被膜形成生长规律,探索利福昔明对金葡菌生物被膜消除影响及分子机制。主要研究内容和结果如下:1 利福昔明和其它抗菌药物对金葡菌MIC、FIC以及利福昔明对金薷菌PAE检测从患乳房炎奶牛乳汁中分离金葡菌,培养至对数生长期,稀释若干倍待用。选择利福昔明和奶牛临床常用药,采用微量肉汤稀释法和微量棋盘法,以金葡菌ATCC25923,以9株金葡菌临床分离株作为研究对象,探讨药物之间相互作用。MIC结果表明,利福昔明对金葡菌ATCC25923 MIC值为0.0156 μg/mL,对8株临床菌株MIC值范围0.0156～0.0312μg/mL,1株临床菌株MIC值为4 μg/mL;氨苄西林MIC值在0.5-4 μg/mL之间;阿莫西林MIC值在0.0625～1 μg/mL之间;苄星邻氯MIC值在0.125～8 μg/mL之间;林可霉素MIC值在2～64 μg/mL之间;卡那霉素MIC值在0.125～64 μg/mL之间;头孢氨苄MIC值在0.25～4 μg/mL之间;头孢噻呋MIC值在0.25～8μg/mL之间;头孢喹肟MIC值在0.125～2 μg/mL之间。FIC结果表明:利福昔明与头孢噻呋联合有7株菌是相加作用,2株表现无关作用,1株表现协同作用;与头孢喹肟联合有2株相加作用,8株无关作用;与头孢氨苄联合有4株相加作用,6株无关作用;与卡那霉素联用的相加和无关作用各占5株;与林可霉素、氨苄西林联用只有1株相加作用,其余均为无关作用;与苄星邻氯联用有3株协同作用,6株相加作用,1株颉颃作用;与阿莫西林联用则均为无关作用。PAE结果表明:利福昔明MIC、2MIC、4MIC、8MIC时,产生0.473～2.995 h不等的PAE,平均为1.800±0.852h。具体数值为:1h的药物接触时间是,0.473 h,1.720 h,1.859 h,2.781 h;2 h 的药物接触时间是,0.851 h,1.767 h,1.950 h,2.995 h。利福昔明对金葡菌PAE与浓度在一定范围内呈现剂量依赖性,不同浓度间PAE相比,差异有统计学意义(P<0.05);随药物接触时间增长,PAE呈现出一定延长,1h与2h相比,差异有统计学意义(p<0.05)。2 金葡菌体外生物被膜生长规律及利福昔明对其消除影响的分子作用机制刚果红平板法、阿利新蓝-刚果红染色法鉴定受试金蔔菌均能够形成生物被膜,结晶紫半定量法对金葡菌生物被膜形成能力程度进行划分,10株受试菌株中,5株菌株的OD值在40Dc～60Dc范围内,为中等程度成膜菌,另外5株OD值均>60Dc,表示产膜强菌株。结晶紫染色法绘制生物被膜7天生长曲线,结果显示:金葡菌生物被膜在生长第4天形成稳定状态,生物被膜生长曲线呈现“S”形态,结果和成膜能力划分相一致。通过结晶紫染色法和银染法直接观察金葡菌生物被膜7天生长过程,同样显示生物被膜生长第4天趋于稳定状态。SEM观察利福昔明1/2MIC值的药物浓度作用24h后,细菌的结构和形态还保持正常;在利福昔明MIC值浓度下作用24h后,细菌之间有网状组织的连结,还可见被破坏的细菌以及一些正常形态的细菌;当利福昔明浓度达到2MIC值浓度下作用24 h后,细菌间几乎没有纤维状的结构,还可见不完整的细菌残迹。说明利福昔明在不同浓度下对金葡菌早期生物被膜有一定抑制消除作用。RT-PCR技术测定利福昔明对菌株ATCC25923icaA和agrC基因表达产生的影响,结果显示:利福昔明浓度的增加均能够影响icaA基因和agrC基因的表达,并且均在一定程度上对其基因的表达量产生了显著的抑制作用(p<0.01),当利福昔明的浓度达到了 2MIC时,其基因的表达量分别降低了 60%和30%之多。