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研究背景血管再狭窄及血栓形成是导致血管球囊成形术或支架植入术后不良事件的主要原因。炎症反应在血管损伤后新生内膜形成过程中具有重要作用。粒细胞以及血小板被激活后可释放大量的炎症介质，是导致血管壁炎症反应的重要原因。血小板、内皮细胞和粒细胞激活后可释放大量的P-/E-/L-选择素，它们通过与其配体P-选择素糖蛋白配体-1（p-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）结合，进一步激活粒细胞和血小板，从而同时促进炎症反应和血栓形成。SSL5为金黄色葡萄球菌的分泌型蛋白，可与粒细胞表面的PSGL-1结合，从而抑制粒细胞在内皮细胞表面的黏附，并可抑制细胞因子对粒细胞的激活作用，同时能够抑制内皮祖细胞与P-选择素的结合。我们在前期工作中已将其与凝血因子Xa（coagulant factor Xa, FXa）的强效抑制剂-蜱抗凝血肽（tickanticoagulant peptide，TAP）通过基因重组技术相融合，成功构建出新型重组融合蛋白TAP-SSL5，其保留了TAP和SSL5的功能，从而具有抗炎、抗凝双重活性；TAP-SSL5可与PSGL-1有效结合，并可明显抑制血浆FXa的活性。本课题在前期研究的基础上，通过建立C57BL/6J小鼠颈动脉内皮损伤模型，进一步研究融合蛋白TAP-SSL5对血管内皮损伤后内膜增生的影响和机制，旨在较全面地评价融合蛋白TAP-SSL5的功能。同时，还研究了TAP-SSL5在兔体内的药代动力学、小鼠体内的组织分布；并采用小鼠和大鼠研究TAP-SSL5的一般药理学作用，以及急性毒性和长期毒性，以对其成药性进行初步评价。研究方法1.融合蛋白TAP-SSL5和重组SSL5蛋白的表达与纯化：按本课题组前期已建立的方法，进行TAP-SSL5和SSL5蛋白的纯化。2.融合蛋白TAP-SSL5对小鼠颈动脉内皮损伤后内膜增生的影响和机制：以金属缠绕型导丝损伤的方法，成功建立C57BL/6J小鼠颈动脉内皮损伤模型，随机分为5组，每组6只，分别为PBS（对照组）、3mg/kg TAP-SSL5组、10mg/kg TAP-SSL5组、13mg/kgSSL5组及假手术组，腹腔注射给药共14天。HE染色检测血管损伤部位新生内膜的形成情况，采用Image Pro Plus6.0软件检测新生内膜和中膜面积、计算内膜/中膜比值；并进一步采用免疫组化染色检测损伤部位血管壁中CD68+细胞（单核-巨噬细胞）、MMP-9和TNF-α的表达。3.融合蛋白TAP-SSL5的药代动力学研究：采用固相氧化法（Iodogen法）将Na125I直接标记于TAP-SSL5，由耳缘静脉给每只大耳兔注射18.5MBq的125I-TAP-SSL5，分别于注射后1.5、3、5、10、30、60、120、240、480min采血，称重并测定放射性计数，换算为血液放射性浓度，经DAS软件分析得出最佳房室模型及相关药代动力学参数；分别测定经尾静脉注射1.85MBq标记物后的昆明小鼠各器官质量和放射性计数，经参考源校正后计算各脏器每克组织百分注射剂量率（%ID/g），研究融合蛋白TAP-SSL5在小鼠体内的组织分布。4．融合蛋白TAP-SSL5的一般药理学及安全性研究：采用昆明小鼠，经尾静脉一次注射TAP-SSL5，剂量分别为1mg/kg、3mg/kg和9mg/kg，研究其对小鼠神经系统的影响；采用SD大鼠，经尾静脉注射TAP-SSL5，剂量分别为1mg/kg和3mg/kg，研究其对大鼠主要生理指标的影响；采用昆明小鼠，尾静脉一次性最大注射给药TAP-SSL5（40mg/kg），给药体积0.5ml/10g，连续观察14天，研究融合蛋白TAP-SSL5对小鼠的急性毒性；采用SD大鼠，腹腔注射给予1mg/kg TAP-SSL5连续8周，停药恢复1周，隔天给药，研究融合蛋白TAP-SSL5对大鼠的长期毒性。结果1．10mg/kg TAP-SSL5可显著抑制小鼠颈动脉损伤后的新生内膜形成，与对照组相比，可使新生内膜面积减少51.6%（p<0.001），使内膜/中膜比值（intima-media ratio）减少37.5%（p<0.001）；10mg/kg TAP-SSL5可有效抑制损伤部位血管壁中TNF-α及MMP-9的表达，与对照组相比，分别抑制了54.1%和33.2%（p<0.001）；10mg/kgTAP-SSL5还可有效抑制血液中CD68+细胞（单核-巨噬细胞）向内膜层的迁移和浸润。2．纸层析法测得125I-TAP-SSL5的标记率为（67.32±9.91）%，放射化学纯度为（91.62±3.22）%，比活度为（30.2±4.4）TBq/μmol；TAP-SSL5在大耳兔体内的药代动力学过程符合权重系数为1的二室模型，分布相半衰期（t1/2α）及消除相半衰期（t1/2β）分别为（0.08±0.04）h和（4.97±0.75）h，清除率（Clearance,Cl）为（0.015±0.011）ml/h，一室向二室转运常数（K12）为（6.651±3.642）/h，二室向一室转运常数（K21）为（4.072±1.737）/h。标记物在健康小鼠体内清除迅速，肺脏、肝脏及肾脏分布较多，但肝脏30min后分布即迅速下降。3. TAP-SSL5对昆明小鼠一般行为情况、协调机能和戊巴比妥钠阈下剂量催眠的协同作用无明显影响；对SD大鼠的血压、心率和呼吸频率无明显影响，与对照组比较均无明显差异（p>0.05）；尾静脉一次最大注射40mg/kg TAP-SSL5，小鼠一般行为情况、血常规及主要脏器形态均正常，无死亡现象；SD大鼠，给予TAP-SSL5（1mg/kg, i.p）8周，停药恢复1周后，体重、血常规、脏器系数、血液生化及主要脏器形态与对照组比较均无明显差异（p>0.05）。结论融合蛋白TAP-SSL5可有效抑制C57BL/6J小鼠颈动脉内皮损伤后新生内膜形成；其机制可能与TAP-SSL5抑制血液中单核-巨噬细胞向内膜层的迁移和浸润，以及减少TNF-α和MMP-9等炎症因子的表达有关；125I-TAP-SSL5在健康大耳兔体内的药代动力学过程符合权重系数为1的二室模型，自体清除率缓慢，可保证与组织有更多的结合几率；融合蛋白TAP-SSL5对小动物的神经系统及主要生理指标均无明显影响，初步表明其用药毒性小、安全性较高，为后续开展大动物实验及规范的成药性研究奠定了良好的基础。