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高危型人乳头瘤病毒(HPV)为双链DNA病毒,其部分基因组会整合入寄主的染色体中,并逐渐引发细胞癌变。HPV整合过程是导致细胞癌变的重要机制之一,但关于其整合特性目前尚未达成统一结论,其整合机制也未完全阐明。为深入研究HPV的整合规律,探索其整合机制,本课题研究了三种有高危型HPV整合的细胞系SiHa, CaSki,以及HeLa中的HPV在基因组的整合位点。使用巢式PCR及测序获得其病毒基因转录的病毒-人源融合mRNA序列,该序列的下游为人基因组序列,因此通过比对mRNA中的人源基因序列部分即可间接推断出病毒在人染色体中整合的位置。研究表明,人染色体中8号染色体24.1-24.2及13号染色体14-31区域的基因荒漠是三种细胞系中整合的病毒选择转录的热点区域。病毒整合的位置在人染色体中大都有三个相同的拷贝,且集中分布于某一染色体的一段区域。同时,整合入染色体组的病毒部分均在E1基因处终止。在其中一条非常特殊的mRNA中发现其上游的病毒mRNA序列与下游的人源序列之间有39个碱基的重叠。HPV感染已被证明为宫颈癌的主要病因,与其他种类癌症发病的相关性,如头颈部癌,乳腺癌,肺癌等,也处于广泛研究中。大量流行病学调查显示,食管癌发病与HPV感染存在一定的相关性。中国为食管癌高发区,每年食管癌新发病例占全世界近一半,近年来,越来越多的证据表明食管癌发病也与HPV感染密切相关。为探索食管癌与HPV感染之间的关系及对其治疗的可行性,本研究利用逆转录病毒载体携带的RNA干扰系统,沉默了整合有18型HPV的食管癌细胞系EC9706中E7病毒基因,并获得了两株稳定下调病毒基因的细胞株—EC9706R8-1及EC9706R8-2。HPV通常会将其E6,E7基因整合进入寄主染色体而调控病毒基因表达复制的E1,E2则往往会在整合过程中丢失,从而导致整合后的E6,E7基因大量表达并与胞内相关蛋白互作,最终导致细胞恶性转化。Real-time PCR检测显示,EC9706R8-1及EC9706R8-2细胞株中的E7基因下调程度明显,在两株细胞株中分别为94.7%及86.9%,同时,E6基因也有一定程度的下调,沉默效果均为50%左右。Western blot的蛋白检测表明,在病毒蛋白E7通路中控制细胞周期的p27蛋白表达量有显著的提高,但P21蛋白表达差异不明显。E6及E7基因下调后,细胞活力也明显下降,证明了整合的HPV所表达的E6,E7蛋白可能是使其细胞活力增加的因素,很可能与食管上皮细胞的癌变过程相关。单独下调E7基因时E6基因的同步下调,以及沉默后p27蛋白的上调,表明类似于整合有高危型HPV的宫颈癌细胞系,在EC9706细胞系中存在E6-E7融合mRNA,E7蛋白在食管癌细胞系中也会干预p27蛋白通路,对细胞周期进行的调控。本研究不仅揭示了一些HPV在人染色体中的整合规律,为进一步研究HPV整合机制提供了有用的证据,同时也充分证明了中食管鳞癌细胞系EC9706中,整合的18型HPV会造成细胞内蛋白网络及细胞表性的变化,为食管癌发病与HPV感染的相关性提供了一定分子生物学实验证据,对HPV相关食管癌的基因沉默治疗研究也奠定了一定基础。成功获得的病毒mRNA下调的稳定细胞系EC9706R8-1及EC9706R8-2,为后续研究提供了便捷的材料。