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食品安全与日常生活和健康息息相关。近年来,食物安全事件在全球频发,致病菌是引起食源性疾病最重要的因素之一,其中单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)由于分布广泛、致病力强且病死率高,在致病菌中占有重要地位。因此快速灵敏的检测单增李斯特菌方法在食品安全领域具有重要的意义。目前常用的检测单增李斯特菌的方法包括传统培养法、酶联免疫分析(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)等,这些方法在单增李斯特菌的检测中发挥了重要的作用,但是却费时费力且操作复杂,不能满足食品安全监督检测的需求。随着生物传感技术的发展,以高特异性抗体为基础的免疫传感技术将是解决快速灵敏检测单增李斯特菌的主要途径。近几年,由于响应快速、简单灵敏和成本低廉等,电化学免疫传感器引起了人们的关注。本研究将致力于开发快速灵敏检测单增李斯特菌的电化学免疫传感器,满足对单增李斯特菌实时快速检测的需要。具体研究内容如下：单增李斯特菌多克隆抗体的制备及标记采用短程免疫方法,八次免疫家兔后获得抗单增李斯特菌血清,利用辛酸-饱和硫酸铵盐析沉淀法进行纯化,SDS-PAGE鉴定抗血清的纯化效果,BCA蛋白定量试剂盒测定抗血清浓度为20mg/mL,间接ELISA测定纯化后的抗血清效价为1：96,000,采用改良的高碘酸钠法将辣根过氧化物酶与单增李斯特菌多抗进行偶联,通过直接ELISA鉴定HRP-pAb偶联成功,紫外分光光度计测得标记效率为0.8。二、单增李斯特菌单克隆抗体的制备利用消减免疫法免疫BALB/c小鼠,以英诺克李斯特菌(Listeria innocua)和威尔斯李斯特菌(Listeria welshimeri)的混合抗原作为耐受原,单增李斯特菌菌体作为免疫原。选取了效价较高的小鼠做融合,经2-3次亚克隆,最终筛选出15株能稳定分泌单增李斯特菌抗体的杂交瘤细胞株,选取其中效价高特异性好的5株C41G11H7、B41B9D5F10、B42D2G4G4、C41B8G7H10、C42B5D12H10进行腹水型单克隆抗体的制备。辛酸-饱和硫酸铵盐析法纯化B41B9D5F10后,ELISA测得抗体的效价为1：106,BCA蛋白定量测定抗体浓度为1.0mg/mL,其亲和常数为2.47×10m L/mol,免疫球蛋白亚类为IgG1。三、电化学免疫传感器的构建与单增李斯特菌的检测利用3-巯基丙酸在金电极上形成自组装膜,通过EDC-NHS混合溶液的活化作用将单增李斯特菌抗体固定到金电极上,开发基于夹心法模式的计时电流法电化学免疫传感器。在整个层层自组装的过程中,以Fe(CN)63-/Fe(CN)64-(1：1)为氧化还原探针,利用循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱(EIS)对免疫传感器进行表征。在优化的条件下,用计时电流法(电压恒定在-0.3V)对单增李斯特菌进行定量的检测,结果表明单增李斯特菌浓度在1.0×102-1.0×106CFU/mL范围内,其对数值与电流响应信号呈良好的线性关系,R2=0.9883,检测限为102CFU/mL,检测时间只需200s。与传统培养计数法进行比较,两者相对标准偏差低于8%；以金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157：H7为对照进行检测,结果表明无交叉反应。将其用于牛奶中单增李斯特菌的检测,得到检测范围为103-106CFU/mL,该传感器不需样品前处理,可直接对牛奶进行检测,且对样品的浊度无要求,适合应用于实际样品的快速检测。本研究制备了高特异性的单增李斯特菌的单克隆抗体和多克隆抗体,将免疫分析与电化学技术结合构建了电化学免疫传感器,用于快速灵敏地检测单增李斯特菌。此方法不仅简单快速,而且价格低廉,不需专业的操作人员,因此在食品安全、公共卫生、环境监测等方面有着很好的实际应用前景。