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木质素是植物细胞壁物质的重要组成部分,在植物体中含量丰富。植物体通过公共苯丙烷代谢途径进入木质素生物合成途径来合成木质素,这条代谢途径涉及到许多酶参与,其中肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是木质素生物合成途径的关键酶。因此,前期我们将BpCCR1基因导入白桦基因组中,获得了过表达和抑制表达株系。为了进一步研究该基因的功能,本研究以35S::BpCCR1转基因株系(过表达株系)、35S::anti-BpCCR1转基因株系(抑制表达株系)和野生型白桦(WT)为材料,分别对转基因白桦的生长、木质素和纤维素含量、次生木质部结构以及耐盐性和抗病性进行了分析。同时对过表达转基因白桦、抑制表达转基因白桦和WT进行了转录组分析,从转录水平上揭示BCCR1与其他基因之间的关系。研究结果如下:(1)将过表达、抑制表达株系以及野生型白桦WT分别进行了 DNA、RNA和蛋白水平的分子检测,表明BpCCR1基因和其反义序列已经分别成功整合到白桦的基因组中,并且能够正常转录和翻译。(2)对1年生和2年生白桦转基因株系的苗高和地径调查发现,1年生16个过表达株系的苗高均低于野生型白桦WT;68.75%的株系的地径比野生型白桦WT低。1年生15个抑制表达株系中只有3个株系的苗高比WT高;有5个株系的地径比WT高。2年生16个过表达株系中,62.5%的株系的苗高低于野生型白桦WT;所有株系的地径均高于野生型WT。2年生15个抑制表达株系中,60%株系的苗高比WT高;15个株系的地径均比野生型白桦WT高。初步认为,BpCCR1基因可以影响白桦的生长发育。过表达BpCCR1基因使白桦植株矮化,抑制表达BpCCR1基因使植株变高。(3)通过测定过表达株系和抑制表达株系的木质素含量和综纤维素含量,发现过表达转基因株系的木质素含量均比WT高,其中C18和C11的木质素含量分别比WT显著高出14.6%和8.4%;过表达转基因株系的综纤维素含量均比WT低,其中C18和C3株系分别比WT显著减少了 7.42%和5.65%。抑制表达转基因株系中,F1和F11两个株系的木质素含量比WT降低了 4.1%和6.3%,综纤维素变化并不明显。(4)对转基因白桦主茎横切面的显微结构进行观察,发现BpCCR1基因可以改变白桦主茎次生木质部导管的结构。过表达株系C18次生木质部导管的数量均比WT多且排列紧密,导管的直径比WT小,导管横切面的排列长度比WT长1-2倍。抑制表达株系F11次生木质部导管的变化与过表达株系呈相反的趋势,但是表现不明显。在此基础上,我们利用扫描电镜对转基因白桦主茎横切面的超显微结构进行观察,发现过表达转基因株系C11和C18的木纤维细胞壁明显加厚,分别为1.56 u m和1.55 μ m,分别比野生型白桦WT高38.05%和37.17%,均达到显著水平;同时,通过番红染色切片,可以观察到C11和C18木质部导管的数量比WT明显增多且排列紧密。而抑制表达转基因株系F1和F11的木纤维细胞壁厚度分别为0.98 μm和0.89 μm,均比WT显著降低了 13.27%和21.24%。结果表明,BpCCR1基因不仅影响白桦的木质素含量,还使白桦次生木质部的木纤维细胞壁厚度、导管排列和数量均发生了改变。(5)本研究分别对过表达、抑制表达及野生型白桦WT进行盐胁迫处理和接种链格孢菌(引起叶枯病的真菌)处理。1%NaCl胁迫发现,3个过表达株系中C3和C18的耐盐能力比WT强,它们的盐害指数分别比野生型白桦WT低29.03%和32.26%,表明它们受到盐胁迫损害的程度比WT低;3个抑制表达株系F1、F11和F12的盐害指数分别比野生型白桦WT高19.35%、9.68%和38.71%,表明它们的受到盐胁迫损害的程度比WT高,即耐盐性比WT弱。对转基因白桦接种叶枯病病原菌发现,4个过表达株系中C7、C8和C18比WT抗叶枯病,它们的病情指数分别比WT低83.56%、78.08%和38.36%;4个抑制表达株系F1、F2、F11和F12分别比WT感病,它们的病情指数分别比WT高35.62%、4.11%、12.33%和17.81%。以上结果说明BpCCR1基因与白桦的耐盐性以及抗叶枯病密切相关。(6)采用Solexa技术测定过表达株系C18、抑制表达株系F11及野生型白桦WT的转录组,通过转录组测序分析,共得到132,427个unigenes,其中47.61%的unigenes得到注释。C18与WT相比,有8243个差异unigenes,其中3362个unigenes上调表达,4881个unigenes下调表达。F11与WT相比共有4657个差异的unigenes,其中2270个unigenes上调表达,2387个unigenes下调表达。GO分析表明C18与WT在植物细胞壁、激酶活性、蛋白激酶活性、转移酶活性和防御或胁迫响应等42个方面差异显著,而F11与WT在细胞壁、木质素分解和代谢途径、苯丙氨酸响应和温度刺激响应等111等方面差异显著。Pathway分析表明,在过表达转基因数据库和抑制表达数据库中,分别有28个和36个代谢途径与对照相比达到显著差异(Q-value<0.05)。同时有23个代谢途径在两个数据中均达到差异显著,包括苯丙素生物合成、次生代谢产物生物合成和植物生理节律等。基于之前的研究,初步认为这些差异基因与BpCCR1基因在改变白桦木质素含量、次生木质部结构以及耐盐性和抗病性等功能相关。对木质素合成途径差异基因的分析表明,BpCCR1基因使许多木质素生物合成途径相关基因表达量发生了显著变化,其中变化最明显的为CAD和HCT。这些差异基因将为我们揭示CCR基因在木质素合成途径中的作用以及分子机理提供参考和依据。