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山核桃(Carya cathayensis Sarg.)为胡桃科(Juglandaceae)山核桃属(Carya Nutt.)重要的木本油料植物。山核桃果实是世界性著名干果,经济价值大,是浙西北山区农民脱贫致富,走向富裕的重要经济支柱,但是山核桃嫁接难以成活,品种难以优化,品质难以提高。研究山核桃嫁接繁殖和嫁接成活的分子机理,为山核桃良种化栽培和选育提供新的理论基础。本文以山核桃的嫁接苗为材料,利用cDNA-AFLP技术获得的山核桃水通道蛋白CcPIP同源基因的EST片段设计特异引物,通过cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术,克隆出山核桃水通道蛋白CcPIP基因全长,并利用定量RT-PCR技术对其表达调控进行初步分析,主要研究结果如下:1.利用改良的CTAB法提取的嫁接样品总RNA质量高、完整性好、无杂质,适用于3’RACE,5’RACE和荧光定量RT-PCR分析。2.利用SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit反转录获得的cDNA,完整性好,满足实验要求。3.利用3′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Kit扩增得到了山核桃水通道蛋白基因的3’序列,长度为450bp,末端具有poly A尾巴的结构,在NCBI数据库比对和Sequencher拼接软件分析结果表明,是水通道蛋白基因3’端序列。4.利用5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Kit扩增得到了山核桃水通道蛋白基因的5’序列,长度为464bp,在NCBI数据库中比对和Sequencher拼接软件分析结果表明,是水通道蛋白基因5’端序列。5.根据已知的序列在两端设计一对引物,以逆转录的cDNA为模板扩增得到了山核桃水通道蛋白同源基因完整cDNA全长。应用NCBI上的BLAST软件进行序列同源性分析,结果显示山核桃水通道蛋白基因与多种水通道蛋白植物的氨基酸序列具有较高的同源性,其中与葡萄和菜豆的同源性最高为99%,接着为棉花和矮牵牛,其同源性都为98%。6.利用ProtParam等相关生物信息软件对获得的山核桃水通道蛋白同源基因cDNA全长分析表明:预测分子量约为20.49KD,理论等电点为5.0,不稳定性指数为49.60,为不稳定蛋白。其开放阅读框架(ORF)长576bp,编码19个氨基酸,其中编码酸性氨基酸8个,碱性氨基酸20个。7.利用定量RT-PCR技术,对山核桃水通道蛋白同源基因进行了时空表达分析,结果表明:山核桃水通道蛋白在芽中表达量最低,其次是雄花序,果实,幼叶和茎。表达量最高的是幼根,这与根系作为水分吸收的主要器官一致。在山核桃嫁接前后,CcPIP基因在接穗中表达趋势和在砧木中的表达一致。CcPIP基因的表达量在山核桃嫁接前砧木和接穗中都有强烈表达,但在嫁接后3d急剧下降,分别在砧木和接穗中下降了5倍和2倍。在随后的11d里,CcPIP基因的表达量在砧木和接穗中开始上升,至嫁接后14d基因的转录水平比嫁接后3d分别增加了7倍和4倍。该CcPIP基因参与山核桃嫁接成活的水分运输过程中起到基因表达调控的作用。8.以PGEM-T-CcPIP为中间载体构建了pCAM-1301-CcPIP植物表达载体,可用于下一步转化拟南芥验证山核桃水通道蛋白基因功能。本研究从分子水平出发,克隆山核桃水通道蛋白cDNA全长,并研究其在山核桃嫁接成活过程中的分子功能,通过转基因技术对山核桃嫁接进行人为调控,为提高山核桃嫁接的成活率,解决山核桃实际生产难题提供理论依据。