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在雌性家畜生殖过程中,容受性子宫内膜是胚胎成功植入的必要条件之一。有研究报道容受性子宫内膜受损是造成胚胎植入失败的重要原因,给畜牧业生产带来了严重的经济损失。有研究发现,非编码RNAs(ncRNAs)在转录后水平上调控基因的表达,并在许多生理过程中发挥关键的调控作用,包括胚胎植入期容受性子宫内膜的建立。本课题组前期研究表明,miRNAs可能在奶山羊容受性子宫内膜的建立过程中发挥重要的调控作用。近年来,有研究报道circRNAs能够作为竞争性内源RNA(ceRNA)通过“分子海绵”吸附miRNAs,并解除miRNAs对靶基因的抑制作用,从而在转录后水平调控基因的表达。然而,circRNAs在奶山羊容受性子宫内膜建立过程中的调控机制尚不清楚。本研究利用高通量测序技术分析在奶山羊容受期(RE,D15)和容受前期(PE,D5)子宫内膜组织中差异性表达的circRNAs,通过RNA干扰(siRNA)、过表达、双荧光素酶基因报告系统、原位杂交、免疫组化、扫描电镜、EdU、Western Blot等技术方法,从circRNA、miRNA和mRNA三个层面,研究其对奶山羊胚胎植入期间子宫内膜上皮细胞(EECs)的调控作用,以及对容受性子宫内膜建立的分子调控机理。本研究主要结果如下:1.circ-8073在奶山羊容受性子宫内膜中的鉴定及其作为ceRNA吸附miR-449a促进EECs增殖本研究通过对奶山羊容受期和容受前期子宫内膜组织进行高通量测序,一共筛选获得334个在RE和PE中差异表达的circRNAs,其中有65个和239个circRNAs分别在RE和PE中特异性表达,有30个circRNAs在这两个时期均有表达。由于circ-8073(circRNA8073)仅在RE中特异表达,而且表达量最高,这表明circ-8073可能在奶山羊容受性子宫内膜建立过程中发挥着重要的调控作用,所以本研究选取circ-8073作为下一步的研究对象。研究发现,circ-8073不仅与其宿主基因CRIM1(Cysteine-rich motor neuron 1,富含半胱氨酸型运动神经元蛋白1)在奶山羊子宫内膜中的表达趋势一致,而且能够通过结合位点与miR-449a靶向结合,抑制miR-449a在EECs中的活性,并促进EECs增殖。2.miR-449/34家族可与circ-8073靶向结合并诱导EECs凋亡miR-449/34家族(包括miR-449a、miR-34a和miR-34c)在奶山羊各组织中广泛表达,且在RE中的表达量均显著上调,且均可诱导EECs凋亡。在EECs中,miR-34a与miR-34c互为正向调控关系,并均上调miR-449a的表达量,但是miR-449a对miR-34a与miR-34c无影响。另外,circ-8073也可以通过“分子海绵”吸附miR-34a和miR-34c,并且与miR-34a或miR-34c在EECs中存在负调控关系。3.miR-449/34家族的靶基因CEP55在EECs中的调控作用本研究通过转录组测序筛选miR-449a在EECs中的靶基因,一共筛选59个差异性表达基因(DEGs),其中7个DEGs下调,52个DEGs上调;进一步鉴定发现,CEP55(Centrosomal protein 55,中心体蛋白55)是miR-449a、miR-34a和miR-34c共同的靶基因,并且miR-449a、miR-34a和miR-34c均下调CEP55在EECs中的表达量。此外,CEP55在RE中的表达量显著低于PE中的,特别在EECs中表达量较低;circ-8073上调CEP55在EECs中的表达水平,而CEP55下调circ-8073的表达量;这表明circ-8073、miR-449/34家族与CEP55在EECs中形成了一个反馈调控网络。然而,CEP55促进了EECs增殖。以上结果表明,circ-8073能够作为ceRNA,并通过吸附miR-449/34家族调控CEP55的表达量,进而促进EECs的增殖。4.CEP55-FOXM1-VEGFA参与奶山羊容受性子宫内膜的建立本研究发现FOXM1(Forkhead box protein M1,叉头盒蛋白M1)和VEGFA(Vascular endothelial growth factor A,血管内皮生长因子A)在RE中的表达量显著高于PE中的,FOXM1通过上调EECs中VEGFA的表达量,参与容受性子宫内膜的建立。此外,FOXM1通过VEGFA-VEGFR2(endothelial growth factor receptor 2,血管内皮生长因子受体2)介导的RAS/RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT/mTOR信号通路促进EECs增殖,从而参与奶山羊胚胎植入期容受性子宫内膜的建立。CEP55与FOXM1在EECs中互为负调控关系,而CEP55下调VEGFA的表达量,以上试验结果表明CEP55参与调控奶山羊容受性子宫内膜的建立过程。5.circ-8073和miR-449/34家族对容受性子宫内膜的调控Circ-8073通过上调FOXM1和VEGFA蛋白在EECs中的表达量,参与容受性子宫内膜的建立。在EECs中,circ-8073激活RAS/RAF/MEK/ERK与PI3K/AKT/mTOR通路,而miR-449/34家族阻断了这两个通路;RAS/RAF/MEK/ERK与PI3K/AKT/mTOR通路之间在EECs中存在反馈调控环和交叉对话。进一步研究发现,miR-449/34家族通过调控EECs中VEGFA、FOXM1和OPN(osteopontin,骨桥蛋白)蛋白的表达,参与子宫内膜容受性的建立。此外,小鼠试验表明miR-449a有助于容受性子宫内膜的建立。综上所述,本试验通过筛选并研究了在奶山羊容受性子宫内膜中特异性表达的circ-8073,并从circRNA、miRNA和mRNA三个层面初步揭示了circ-8073作为ceRNA协同miR-449/34家族通过CEP55-FOXM1-VEGFA参与调控奶山羊容受性子宫内膜的建立过程。另外,本研究为进一步研究奶山羊容受性子宫内膜建立的分子调控机制提供基础,对提高奶山羊受胎率的研究具有重要的理论指导意义,对促进奶山羊产业发展具有重要实践意义。